OnePot PURE 无细胞体系

这种重组无细胞蛋白表达系统（通常称为PURE系统）的实验方案利用细胞培养和细胞纯化来简化所需的蛋白纯化步骤，显著减少了时间和劳动投入。OnePot方法被证明不仅具有成本效益，而且时间效率高。

它将制备时间从数周缩短至三个工作日，使全球更多实验室能够使用PURE无细胞平台，并有助于推广这一功能强大的合成无细胞生物学平台。在开始之前，请确保所有菌株均能良好地过表达其相应的蛋白质。

首先，按照文稿中所述方法，使用 2 毫升 Sepharose 树脂制备 OnePot 蛋白纯化柱，然后用硫酸镍对层析柱进行上样。通过将 20 毫升 LB 培养基与 20 微升氨苄青霉素混合，制备起始培养物。将 300 微升培养基加入无菌 96 深孔板的 35 个孔中。

除延长因子热不稳定蛋白（EFTU）外，分别向每个培养物中接种相应的菌株，并用透气膜密封培养板。对于EFTU培养物，取3毫升含氨苄青霉素的LB培养基加入14毫升带卡扣盖的培养管中，并接种EFTU。每3毫升EFTU培养物足以用于一次OnePot表达培养。

在37摄氏度、260转/分钟振荡条件下过夜培养。第二天，将500毫升LB培养基和500微升氨苄青霉素加入无菌挡板烧瓶中。用1,675微升EFTU培养物以及深孔板中每种培养物各55微升，接种OnePot PURE培养体系。

将培养物在37摄氏度、260转/分钟振荡条件下孵育2小时，或直至培养物的光密度达到0.2至0.3。加入500微升0.1毫摩尔的IPTG诱导培养物，并继续培养额外3小时。在4摄氏度、3,220 × g条件下离心10分钟收集细胞，并将细胞沉淀于-80摄氏度保存，直至后续使用。

第三天，测定纯化所需的缓冲液体积，并按照文中说明向所有缓冲液中加入TCEP。将未添加TCEP的剩余缓冲液于4°C保存，用于后续纯化。用30毫升缓冲液A平衡已上样柱子。当25毫升缓冲液A流经柱子后，关闭柱子底部。

解冻细胞，用移液管将细胞沉淀重悬于7.5毫升缓冲液A中。使用130瓦的探头进行细胞裂解。若超声成功，溶液会变深。确保将细胞保持在冰上，并将探头插入足够深度，但不要接触管壁。

在 4 摄氏度下以 21,130 × g 离心 20 分钟，去除细胞碎片，并将裂解液置于冰上保存。将上清液加入已平衡的层析柱中。从顶部关闭层析柱，并确保无泄漏。

将柱子置于4°C下，使用试管旋转仪旋转孵育三小时。从柱子中洗脱未结合组分，并用25毫升缓冲液A洗涤。用25毫升25毫摩尔咪唑缓冲液洗涤柱子。用5毫升450毫摩尔咪唑缓冲液洗脱蛋白质，并始终将洗脱的蛋白质置于冰上保存。

用25毫升HT缓冲液稀释洗脱液，并将混合物置于冰上。取15毫升加入15毫升离心过滤管中，浓缩至1.5毫升体积。将剩余的15毫升加入含有浓缩液的滤管中，再次浓缩至1.5毫升。

向浓缩样品中加入10毫升HT缓冲液，浓缩至1毫升。回收浓缩样品，加入等体积的储存缓冲液B，于-80摄氏度保存，直至后续使用。在缓冲液置换过程中，按照文中所述方法恢复层析柱。

第四天，使用 Bradford 法测定蛋白浓度。使用 0.5 毫升截留分子量为 3 千道尔顿的离心过滤器将样品浓缩至 20 毫克/毫升。通过 SDS-PAGE 验证 OnePot PURE 蛋白的组成。

取2.5微升样品，加入7.5微升水和10微升2× Laemmli缓冲液混合液进行稀释，然后分别上样5微升和2.5微升至凝胶中。按照文中所述条件运行SDS-PAGE。在电子表格中对应的黄色单元格内填写DNA的浓度和长度，反应中使用DNA的浓度范围为2至10纳摩尔。

填写所需的总体反应体积（单位：微升）。从冷冻柜中取出所需的试剂，并在冰上解冻。然后，将计算好的水量、DNA 和能量溶液加入 PCR 管的一侧或 384 孔板中某一孔的角落处。

用移液器将计算好体积的蛋白质和核糖体溶液加入PCR管的另一侧，或384孔板的对角孔中。离心约30秒，使反应组分混合。为防止在酶标仪实验过程中发生蒸发，加入35 µL液体石蜡，并用透明封板膜密封。

在 37 摄氏度下孵育至少三小时。使用酶标仪检测时，每两分钟在所需波长下测定一次荧光强度。此处展示了后续用于 OnePot 蛋白制备的所有单个菌株中成功的过表达结果。

通过SDS-PAGE分析了最终OnePot PURE蛋白溶液的整体组成。可以明显观察到，与其他蛋白相比，EFTU的浓度更高，这与预期一致。通过监测eGFP荧光随时间的变化，分析了OnePot蛋白溶液与His标签化或非标签化核糖体结合后的蛋白合成产量。

通过SDS-PAGE凝胶分析了使用绿色列表tRNA体外标记系统或Kumasi染色法标记的三种不同蛋白质的表达水平。对于一个具有功能的PURE系统而言，所有菌株均能良好表达其相应蛋白质至关重要。该技术促进了PURE系统在生物系统工程中的应用，从而推动新型基因网络、分子诊断、治疗手段及教育套件的开发。