用于分离多种循环肿瘤细胞的临床微流控芯片平台

本方案描述了一种红色肿瘤细胞计数及临床循环肿瘤细胞（CTC）分离的方法。首先，在细胞培养瓶中培养肿瘤细胞 MCF-7、MDA-MB-231 和 HeLa，接种密度为每毫升 DMEM 培养基中 1 × 10⁵ 个细胞，DMEM 培养基中添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。

当细胞系以贴壁单层形式生长至95%融合度时，用0.25%胰蛋白酶溶液将其从培养皿中消化脱落，作用时间为两分钟。加入三微升Calcein AM对肿瘤细胞进行染色，并将培养皿放入培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，用胰蛋白酶消化所有细胞。

使用细胞计数板在 PBS 中对培养的肿瘤细胞进行计数，并稀释至每毫升 PBS 中含有 100 个肿瘤细胞。接着，使用注射泵以不同的流速通过注射器将稀释后的细胞悬液引入微流控芯片中。测定不同流速下的捕获效率，并确定最佳流速。

统计芯片上捕获的肿瘤细胞数量以及从出口流出的肿瘤细胞数量，利用给定公式计算捕获效率。重复该步骤，获得不同数量肿瘤细胞（从10到100）的捕获效率。

对微流控芯片检测稀有肿瘤细胞的能力进行测试和验证。使用经拉针仪制备的空心针头吸取稀释后的肿瘤细胞，将这10个样本悬液注入微流控芯片中。在芯片上捕获肿瘤细胞后，对每个样本中的肿瘤细胞进行检测并计数。

接下来，用 Calcein AM 对肿瘤细胞进行染色，并在 5 微升 PBS 中计数 100 个肿瘤细胞。将这些细胞加入 1 毫升完整的正常血液样本中。将此细胞混合物注入芯片，通过绿色免疫荧光计数芯片上捕获的肿瘤细胞数量。

按照所述方法进行体内计数，并在捕获后计算捕获效率。无需染色即可对一至十个肿瘤细胞进行计数。将这些细胞加入一毫升完整的正常血液中。

将这些样本引入微流控芯片，并捕获肿瘤细胞。在20至30微升PBS中加入三至五微升荧光染料，并用注射器将该溶液注入芯片。通过蓝色和绿色免疫荧光对芯片上捕获的肿瘤细胞数量进行计数，以确定捕获效率。

接下来，在室温下用 100 µL 的 4% 3-巯基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液处理芯片表面 45 分钟，以实现对上皮细胞黏附分子抗体的亲和捕获。孵育结束后，用乙醇洗涤芯片三次。然后加入 100 µL 偶联剂 GMBS，反应 30 分钟。

孵育结束后，使用注射器用一毫升 PBS 洗涤芯片三次。将芯片在室温下用 30 至 40 微升浓度为 10 微克/毫升的中性亲和素处理 30 分钟，使细胞固定在 GMBS 上，然后用 PBS 冲洗以去除多余的亲和素。用三微升抗生物素化上皮细胞黏附分子抗体修饰芯片，并在 4°C 下孵育过夜。

所有肿瘤细胞均被捕获在声波芯片的阵列周围，无一遗漏，表明该微流控芯片具有高捕获效率。此处显示的是用Hoechst和Calcein AM染色的肿瘤细胞。此处还展示了利用小型椭圆微滤器捕获的胃癌患者循环肿瘤细胞（CTCs）。

此外，还展示了使用梯形微滤器捕获的结直肠癌患者循环肿瘤细胞（CTCs），这些细胞同时发出蓝色和绿色荧光。使用大椭圆微滤器捕获的肿瘤细胞表现出较高的捕获效率和细胞活性。对在微流控芯片上捕获的结直肠癌CTCs进行临床免疫荧光分析，结果显示CTCs为DAPI阳性、CK阳性、CD45阴性，而白细胞（WBCs）为DAPI阳性、CK阴性、CD45阳性。

捕获后，在大椭圆芯片上培养的结直肠肿瘤细胞，以及在大椭圆微滤膜上捕获的结直肠肿瘤细胞如图所示。这种利用适配体进行修饰的方法为富集循环肿瘤细胞（CTC）分离提供了新途径。