无细胞蛋白质合成系统用于构建合成细胞

我们的所有研究均聚焦于无细胞合成生物学。该领域包括合成细胞的自下而上组装、膜蛋白的功能与结构分析、结合非经典氨基酸的蛋白质工程以及无细胞代谢工程。目前，除了无细胞蛋白质合成之外，通过软光刻技术进行微加工制备的微流控装置、生物相容性材料的开发以及通用人工智能，是推动无细胞合成生物学快速发展的前沿技术。

本方案所呈现的配置建立了一个简单而稳健的系统，适用于多种微区室环境，包括我们在代表性结果中展示的液滴法GUVs（大单层囊泡）作为基础体系。未来，我们将致力于开发定制化的无细胞系统，以实现不同模块化细胞模拟系统的组装与整合，最终构建出最小细胞。首先，获取预培养的细胞，并用35毫升预冷的S30缓冲液A洗涤两次。离心收集细胞沉淀，然后将其重悬于S30缓冲液B中。为了破碎细胞，将细胞悬液转移至法国压榨仪的金属破碎室中，并使用安全锁将其固定在液压平台上。

打开液压泵并开始破碎细胞。调节出口阀，将细胞悬液收集到一个新的50毫升离心管中，保持压力为17,000磅/平方英寸。将所得裂解液在4摄氏度、30,000 G条件下离心30分钟，并收集上清液。

再次离心，收集上清液，加入0.3倍体积的预孵育缓冲液，在37摄氏度下轻轻振荡孵育80分钟。将所得液体混合物在4摄氏度下，用2升S30缓冲液C透析过夜，持续两小时。离心透析后的样品，分装上清液。

立即将样品在液氮中快速冷冻。培养细胞离心后，重悬于30毫升T7缓冲液A中。使用法国压榨机以15,000磅每平方英寸的压力使细胞裂解一次，随后离心裂解液以去除细胞碎片。逐滴加入硫酸链霉素至 supernatant，使其终浓度达到4%。冰上短时间孵育后，再次以相同条件离心裂解液。

将过滤后的样品上样至强阴离子交换柱。洗涤柱子后，以每分钟3毫升的流速，用10倍柱体积的T7缓冲液C洗脱样品。加入甘油，使其终浓度为10%，并将所得混合物进行超滤，以获得终浓度为每毫升3至4毫克的溶液。

首先，获取含有表面活性素的氟化油或脂质矿物油溶液。将无细胞蛋白合成（CFPS）混合物加入到1.5毫升离心管中预先配制好的500微升油相中，并在试管架上用力摩擦试管50次，以形成细小液滴。对于巨型单层囊泡（GUV）的制备，向4毫升玻璃小瓶中加入57微升氯仿，随后加入脂质18微升，使其终浓度为8毫摩尔。

在氩气流下蒸发氯仿15分钟，然后在真空条件下继续蒸发1小时。将所得的干燥脂质溶解于1,500微升矿物油中，使其终浓度为400微摩尔。为形成界面脂质层，取1.5毫升离心管中的外相溶液500微升，缓慢地将250微升脂质矿物油溶液铺加在其上方。

室温孵育30分钟，以形成稳定的界面脂质层。对于内溶液，将T7 RNA聚合酶、S30提取物和DNA模板加入预冷的内溶液中。取50微升内溶液与500微升脂质矿物油混合，并剧烈涡旋振荡。

将离心管置于冰上10分钟，然后缓慢加入20微升该乳化混合物至1.5毫升离心管中先前制备的油相顶部。在4摄氏度下以约800×g离心10分钟，观察离心管底部巨型单层囊泡（GUVs）的形成。移除上层油相后，小心地从离心管底部吸取30微升GUVs。

在盖玻片中央加入七滴硫酸和两滴50%过氧化氢，孵育45分钟。用超纯水彻底冲洗后，将其粘附到一个切开的0.5毫升微量离心管上。在紫外灯下固化10分钟，形成反应室。

接下来，向预先制备的反应室中加入 75 µL 小型单层囊泡（SUV）悬浮液，并在 37 °C 的加热块中孵育 1 分钟。然后向反应室中加入 150 µL 支持性脂双层（SLB）缓冲液 A，继续孵育 2 分钟。在更换为 S30 缓冲液 C 之前，用 200 µL SLB 缓冲液 B 清洗反应室，清洗后保留 100 µL 缓冲液于反应室内，以防止支持性脂双层干燥。

利用共聚焦激光扫描显微镜，成功捕获了液滴中包裹的绿色荧光蛋白和mCherry的表达。在标记的脂双层内的GUVs中包裹的CFPS的荧光图像显示了超级折叠绿色荧光蛋白的表达。