处理后蛋白质聚集体的提取与可视化 大肠杆菌 使用蛋白毒性应激剂

暴露于应激环境可导致蛋白质聚集，并引起细菌表型行为的显著改变。本视频中描述的方法可在应激处理后实现蛋白质聚集体的提取与可视化。与其他已发表的方法相比，该方案所需细胞数量更少，且无需复杂的物理破碎过程，也无需耗时的洗涤和孵育步骤。

该方案可用于研究多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的蛋白质聚集现象。您还可以分析基因敲除的影响，或比较蛋白毒性化合物的效果。首先，分别挑取大肠杆菌MG1655菌株和尿路致病性大肠杆菌CFT073菌株的单菌落，各自接种于5 mL的LB（Lysogeny Broth）培养基中。

将两种液体培养物在37摄氏度、300 rpm条件下培养14至16小时。将每种菌株稀释至600纳米处的光密度（OD600）为0.1，接种于含有70毫升MOPS-g培养基的500毫升锥形瓶中。将锥形瓶在37摄氏度、300 rpm条件下培养，直至达到对数中期。

孵育后，将每种培养物各20毫升转移至三个预热的125毫升锥形瓶中，在37摄氏度、300转/分钟条件下孵育2分钟。在MOPS-g培养基中配制浓度为2毫克/毫升的抗菌化合物溶液。将该溶液加入各培养物中，使其达到所需浓度，并向未处理对照组加入相应体积的MOPS-g培养基。

在施加胁迫处理45分钟后，测定每种培养物的OD600。对于每个样品，取OD600为1的4毫升培养物，分装至15毫升离心管中。用50微升预冷的裂解缓冲液重悬细胞沉淀。

将样品置于冰上孵育30分钟。向样品中加入360 µL预冷的缓冲液A，用移液器轻轻混匀。将样品转移至2 mL微量离心管中，加入约200 µL的0.5 mm玻璃珠。

将离心管置于ThermoMixer中，在8摄氏度下以1400 rpm振荡孵育30分钟。随后将离心管置于冰上静置5分钟，不进行振荡，以使玻璃珠沉降。然后将200微升细胞裂解液转移至1.7毫升微量离心管中。

将细胞裂解液在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。收集上清液，后续将用作可溶性蛋白样品。用移液器将沉淀重悬于 200 µL 冰冷的缓冲液 A 中。在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。

然后小心彻底弃去上清液。用移液器将沉淀在 200 微升预冷的缓冲液 B 中轻轻重悬。再次离心试管，并小心弃去上清液。接着用缓冲液 A 重复洗涤一次。将沉淀重悬于 100 微升 1× 还原型 SDS 样品缓冲液中，在 95 °C 的 ThermoMixer 中煮沸 5 分钟。

取一份体积的100%三氯乙酸（TCA）与四份体积先前收集的可溶性蛋白样品混合，在4°C条件下孵育10分钟以沉淀蛋白质。在21,000 × g、4°C条件下离心5分钟，收集沉淀物，并弃去上清液。用200 µL预冷的丙酮洗涤沉淀，以去除细胞碎片。

再次离心样品以获得沉淀，并移除上清液。为去除沉淀中残留的丙酮，将微量离心管敞盖置于 ThermoMixer 中，在 37 摄氏度下孵育。然后加入 100 微升 1x 还原性 SDS 缓冲液，彻底溶解沉淀，并在 95 摄氏度下煮沸样品 5 分钟。

立即在SDS聚丙烯酰胺凝胶上加样以进行分离，或在-20摄氏度下保存样品以备后续使用。按照文本稿件中的描述制备两块分离胶。使用1毫升移液器将凝胶液注入玻璃板之间，确保上部两厘米区域不加混合液。

在分离胶上加入70%乙醇，形成两层之间的平整界面。待分离胶聚合完成后，按照文稿中的说明制备浓缩胶。随后去除分离胶上的乙醇，并加入浓缩胶溶液。

小心插入具有所需数量孔穴的梳子，避免产生气泡，并让凝胶在室温下聚合 20 至 30 分钟。将每个样品以及蛋白质ladder各取 4 µL，分别加入不同的加样孔中。然后在室温下，以 144 伏电压在三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸电泳缓冲液中电泳运行 45 分钟。

使用预热的 Fairbanks 溶液 A 在摇床中染色凝胶 30 分钟，并使用预热的 Fairbanks 溶液 D 在摇床中脱色凝胶，直至达到理想的背景效果。当细胞经 175 微克/毫升和 200 微克/毫升的抗菌剂处理后，与未处理细胞相比，形成的蛋白质聚集体数量增加。在更为敏感的 MG1655 菌株中，不溶性蛋白质组分的增加更为显著。

与未处理的细胞相比，当细胞用175微克/毫升和200微克/毫升的抗菌剂处理时，可溶性蛋白的量减少。在尝试本方案时，请注意，为比较样品中蛋白聚集程度，归一化至600纳米处的光密度非常重要。