使用扫描电子显微镜观察膜皱褶的形成

本扫描电镜成像方案提供了一种用于在体外可视化并量化细胞表面膜皱褶形成、环状突起以及巨胞饮杯状结构的工具。扫描电镜可提供细胞表面的高分辨率图像，可用于观察巨胞饮过程中的膜活动。该技术可用于发现调控巨胞饮作用的新信号通路，并鉴定微胞饮作用的新型激动剂和抑制剂。

使用经高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。然后以每毫升10的6次方个细胞的密度将RAW 264.7巨噬细胞接种到盖玻片上，并在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中培养过夜。次日，将每孔中的培养基更换为500微升新鲜完全培养基，随后用溶剂对照物（如DMSO）或大胞饮抑制剂（如EIPA）对巨噬细胞预处理30分钟。

接下来，为了促进细胞膜皱褶的形成，使用大胞饮作用刺激剂处理细胞30分钟，例如1微摩尔的PMA溶液或每毫升100纳克的巨噬细胞集落刺激因子。为进行扫描电子显微镜观察而固定细胞时，吸出孔板中的培养基，用预冷的PBS洗涤盖玻片两次，随后在室温下将盖玻片置于固定液中孵育30分钟，接着在4摄氏度下过夜孵育。次日，在不扰动细胞单层的前提下，轻轻洗涤盖玻片，然后将其在500微升0.1摩尔的二甲胂酸钠溶液中孵育15分钟。

用500微升蒸馏水清洗两次后，再用500微升梯度乙醇溶液清洗盖玻片两次，每次清洗孵育10分钟。进行临界点干燥时，将盖玻片放入临界点干燥仪中，并用100%乙醇覆盖。然后按下电源按钮并打开二氧化碳气罐。

按下冷却按钮约30秒，直至温度降至0摄氏度。然后，按下填充按钮，直到腔室窗口中出现气泡。接着，按下吹扫按钮，直至吹扫排气口处的乙醇气味消失。

然后，再次按下冷却按钮，直到温度降至零摄氏度。重新按下“满”和“排空”按钮以关闭它们。随后，关闭二氧化碳气罐。

重新按压冷却底部以关闭，然后按下加热按钮。将温度设置为 42 摄氏度，压力设置为 1 200 磅每平方英寸。待压力和温度稳定后，按下排气按钮，使压力缓慢降低。

当腔室压力达到150磅每平方英寸时，按下排气按钮，并等待压力降至0磅每平方英寸。关闭临界点干燥仪并取下盖玻片。接下来，使用碳导电胶带将盖玻片固定在铝制样品台（用于扫描电子显微镜）上，然后在溅射镀膜仪中使用金或钯进行溅射镀膜。

打开溅射镀膜仪的电源开关。当真空度达到30毫托时，关闭气体开关，并逆时针旋转细调气体阀门，以冲洗腔室，去除湿气和空气。当真空度上升至200毫托后，再次关闭气体开关，并等待真空度降至30毫托。

然后，再次冲洗腔室以去除湿气和空气，操作如前所示。冲洗腔室三次后，按下计时器按钮，并调节电压旋钮，直至仪表读数为10毫安。随后，从腔室中取出镀膜的盖玻片。

为了观察和定量分析膜皱褶，将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的样品室中，关闭舱门，然后按下抽真空按钮。打开显微镜操作软件，将加速电压设置为15千伏，工作距离设置为10毫米。按下“坐标”按钮，移动控制器，直至细胞出现在观察屏幕中央。

将放大倍数设置为 3,500 X，然后点击“照片”按钮对样品进行成像。图中显示的是具有代表性的扫描电子显微镜图像，展示了经 PMA 和巨噬细胞集落刺激因子处理后 RAW 264.7 巨噬细胞中膜皱褶的形成。用巨胞饮抑制剂 EIPA 对巨噬细胞进行预处理可减弱膜皱褶的形成。

在皱褶形成过程中，细胞质膜会经历一系列明确的形态学阶段，包括片状膜突起、C形膜皱褶以及巨胞饮杯状结构。使用佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）和巨噬细胞集落刺激因子处理后所诱导的膜皱褶形成可通过扫描电子显微镜进行定量分析，而巨胞饮作用的形成则可通过其他成像技术加以验证，例如使用Texas red葡聚糖和FM4-64的共聚焦显微镜观察。蓝色箭头指示膜皱褶结构，黄色和绿色箭头则分别指向微胞饮体。

最后，可通过流式细胞术结合荧光液体示踪剂（如FITC或Texas red葡聚糖）来确认并定量大胞饮作用。除了扫描电镜外，还可通过活细胞成像和荧光标记葡聚糖内化作用的流式细胞术分析，对大胞饮作用进行研究和定量。