利用扫描电子显微镜定量分析膜皱褶的形成

外部刺激物可激活细胞并诱导形成三维环状膜突起，即膜皱褶，这对多种细胞活动至关重要。

为了观察膜皱褶的形成，首先准备一个底部带有盖玻片的多孔板。盖玻片表面培养有巨噬细胞。

用刺激分子处理这些巨噬细胞，以激活细胞，促进细胞骨架的重排和膜突起的形成。用固定剂溶液覆盖细胞，使蛋白质交联，从而保存细胞结构。

用梯度酒精对固定的巨噬细胞进行处理，以实现完全脱水。使用临界点干燥仪对这些巨噬细胞进行干燥，彻底去除残留水分，以获得更佳的成像效果。

使用导电胶带将盖玻片固定到扫描电子显微镜（SEM）样品台上。对含有巨噬细胞的盖玻片进行溅射镀膜，覆盖一层薄金属，以确保成像过程中具有良好的电子导电性。

将盖玻片放入扫描电镜样品室。将电子束聚焦于盖玻片上。电子束撞击经金属包被的巨噬细胞膜，导致膜表面产生低能二次电子。

三维突起与膜的其余部分对电子的散射方式不同，从而凸显细胞表面的这些特征。探测器收集来自细胞表面不同区域的散射电子，生成具有对比度的图像。

在扫描电镜图像中，巨噬细胞呈现较暗的形态，表面有明亮的圆形突起，证实了皱褶的形成。

使用已灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。然后，以每毫升10⁶个细胞的密度将RAW 264.7巨噬细胞接种到盖玻片上，并在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育过夜。

第二天，将每孔中的培养基更换为500微升新鲜的完全培养基，然后使用溶剂对照物（如DMSO）或大胞饮抑制剂（如EIPA）对巨噬细胞预处理30分钟。接着，为促进细胞膜皱褶形成，使用大胞饮刺激剂处理细胞30分钟，例如1微摩尔的PMA溶液或100纳克/毫升的巨噬细胞集落刺激因子。

为进行扫描电子显微镜观察而固定细胞时，吸出孔板中的培养基，用预冷的 PBS 洗涤盖玻片两次。随后在室温下用固定液孵育 30 分钟，接着在 4 摄氏度下孵育过夜。

次日，在不扰动细胞单层的情况下，轻轻洗涤，然后将盖玻片在 500 微升 0.1 摩尔的二甲胂酸钠溶液中孵育 15 分钟。用 500 微升蒸馏水洗涤两次后，再用 500 微升梯度乙醇溶液洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。

进行临界点干燥时，将盖玻片放入临界点干燥仪中，并用100%乙醇覆盖，然后按下电源按钮，打开二氧化碳气罐。按下冷却按钮约30秒，直至温度降至0摄氏度。随后按下填充按钮，直至观察窗中出现气泡。

接下来，按压吹扫按钮，直至吹扫排气口处的乙醇气味消失。然后再次按压冷却按钮，直到温度降至0摄氏度。重新按压填充和吹扫按钮以将其关闭。随后关闭二氧化碳气罐。再次按压冷却按钮将其关闭，然后按压加热按钮。将温度设定为42摄氏度，压力设定为1,200磅每平方英寸。

当压力和温度稳定后，按下排气按钮，使压力缓慢下降。当腔室压力降至150磅每平方英寸时，按下通气按钮，并等待压力降至0磅每平方英寸。关闭临界点干燥仪，取出盖玻片。

接下来，使用Carbon Adhesive标签将盖玻片固定在铝制样品台上，用于扫描电子显微镜观察。然后，在溅射镀膜仪中使用金或钯进行溅射镀膜。

打开溅射镀膜仪的电源按钮。当真空度达到30毫托时，关闭气体开关，并逆时针旋转细调气体阀门，以冲洗腔室，去除湿气和空气。当真空度上升至200毫托时，关闭气体开关，等待真空度再次降至30毫托，然后按照上述方法再次冲洗腔室。重复冲洗腔室三次后，按下定时器按钮，并调节电压旋钮，直至电流表读数为10毫安。随后，从腔室内取出已镀膜的盖玻片。

为了观察和量化细胞膜皱褶，将样品载玻片插入扫描电子显微镜的样品室中。关闭舱门并按下Evac按钮。打开显微镜操作软件，将加速电压设为15千伏，工作距离设为10毫米。点击Coordinates按钮，移动控制器直至细胞出现在观察屏幕中央。将放大倍数设为3500倍，然后点击Photo按钮对样品成像。