使用扫描电子显微镜进行靶向获取体积信息的阵列断层成像工作流程

电子显微镜分析通常较为复杂。我们认为，本方案有助于对大样本表面及中间体积的电镜数据进行处理和采集。本方案有助于在连续切片中定位目标结构。

数据记录仅限于必要的内容。与在整块组织中进行数据采集相比，记录时间缩短，数据分析也更为简便。鉴于该方法整体上的便捷性，我们认为它不仅可用于解答科学问题，还可作为诊断工具使用。

为生成用于分析的切片阵列，首先将样品固定在超薄切片机的样品夹上，使用剃须刀片粗略修整样品周围的树脂。接着使用金刚石修块工具对样品进行精细修整，并使用倾斜角为20度或90度的修块刀，确保样品块的顶部和底部表面与刀刃的切割边缘平行。按3:1的比例混合二甲苯和胶水，用固定在牙签上的睫毛将混合物涂抹于修整后样品块的顶部和底部边缘。

在混合物干燥的同时，使用晶圆切割工具将晶圆切割成适合分析的适当尺寸。晶圆干燥后，先用蒸馏水清洗以去除任何碎屑，再用等离子体清洁表面。准备阵列断层扫描刀时，使用泡沫胶带将一根针固定在组织学大型刀片的底部，然后将刀片以零度角度放入超薄切片机的刀架中。

调整刀片边缘与包埋块表面平行，并将修整好的包埋块移至刀刃边缘，准备切片。将洁净的载网放入刀槽中，并向槽内加水至水位与刀刃齐平，然后使用附带的注射器酌情加水或吸水，使刀片的金刚石刃口充分润湿。进行阵列切片时，将切片机设置为切片厚度50至100纳米、切片速度6至1毫米/秒，开始切片，获得足够长的切带以覆盖目标Z轴体积。

根据切块大小、组织的均一性以及树脂类型，切出的切带将大致呈直线状。使用干净且无粘性的睫毛尖端将切带从刀刃上轻轻剥离，并用睫毛轻轻将切带移至支撑介质的中央位置。

必要时可使用氯仿或加热笔来展平切片。展平后，回抽注射器以开始排出水分。对于更精细的切带或需要更缓慢地排水时，可将注射器从软管上取下，使水自然滴落。

当水位达到晶圆高度时，轻轻将带状物推至盆的中央，并继续排水，直至盆中所有剩余的水完全排尽。将晶圆置于洁净环境中自然干燥。干燥过程大约需要30分钟。

当样品完全干燥后，将芯片转移至密闭盒中，以防灰尘污染。然后将盒子放入60°C的烘箱中至少30分钟。为获得显示晶圆上切片区位置的扫描电镜（SEM）图像概览图，可使用内置光学相机采集覆盖一排切片区域的SEM图像。

要创建一幅拼接图像，请点击并拖动样本的相机图像，然后启动自动采集。以更高分辨率采集概览图像，以找到目标结构。如果仅需对少数几个区域进行成像，可使用可缩放查看器在原始位置查看已采集的图像。

确定需要高分辨率成像的区域后，单击并拖动以创建成像区域，然后选择高分辨率成像设置，并将这些设置保存至模板。为查找特别微小或难以检测的稀有事件，可每隔10个切片或每条切片带中选择一个切片，应用高分辨率成像设置，手动创建成像区域并采集图像。随后查看所获取的图像，并标记出包含目标区域的切片。若需连续采集超过10个切片，可使用切片定位功能自动识别所有切片。

如果概览图像未显示清晰的兴趣区域，则需对切片进行更高分辨率的成像，并使用切片预览功能自动创建并获取图像。为确定最佳成像参数，请在显微镜控制软件中启动实时成像，导航至一个兴趣区域，然后根据制造商的指南调整成像参数，直至图像显示出清晰的兴趣区域，同时避免过长的图像采集时间。为优化连续切片上成像区域的定位，请放大至目标图像，然后单击“开始位置优化”以提高已配准切片位置的精确度。

要定义成像区域，请在按住 Alt 键的同时，单击并拖动任意切片上的某个区域，然后从弹出的上下文菜单中选择“创建平铺集阵列”。软件将在已找到或先前标记的所有切片中，于相同相对位置创建成像区域。然后根据需要为每个图像序列设置像素数、像素大小、平铺布局以及像素驻留时间。

要配置自动功能，请如图所示为自动功能创建一个独立的图像序列，并将该图像序列移至包含高对比度结构的区域位置。将图像序列设置为 1024 x 884 像素，并选择与图像序列中使用的最高分辨率相对应的像素尺寸。在自动功能列表中，勾选自动聚焦（Auto focus）和自动消像散（Auto stigmator）。

在采集序列控制中选择二分法，并确认自动功能的图像位于列表中的第一项，然后单击“全部采集”以开始图像采集。当所有成像序列均已创建并设置完毕后，这些序列将列在作业队列中。低分辨率采集可手动或自动执行，针对切片的选定部分或整个切片，采用单幅成像或马赛克成像，随后进行图像拼接。

然后可以使用高分辨率参数获取所选区域的图像，以观察线粒体、细胞核和微绒毛等结构。在自动获取已解析的镶嵌图并选定后，可裁剪出多个感兴趣区域，或利用这些区域定义更精细的局部成像范围。尽管果蝇肠道中不同类型的特化细胞呈随机分布，但在使用高分辨率参数对单个切片或一系列连续图像进行筛选后，这些细胞可被直观区分。完成图像对齐后，图像堆栈可通过多种软件方案进行三维重建与渲染。

阵列断层分析技术可以在单个晶圆上生成多个连续切片，并使用低分辨率参数进行筛选，以定位感兴趣的大概区域。这些区域可被靶向用于进一步的高级采集参数分析。例如，由于细胞相对于分裂区较大，在超微结构水平上定位胸片区域的有丝分裂较为困难。

然而，利用该方法，可通过 20 到 40 个切片的中等分辨率自动概览图像来定位分裂细胞。阵列断层扫描技术提供了更为直接的电子显微镜数据分析流程。我们鼓励研究者投入时间掌握再生技术，并熟悉与图谱相关的操作流程。根据我们的经验，很少有研究课题需要对整个动物或完整器官进行超微结构分析。

我们的方法有助于快速定位组织中的细胞及其相互作用伙伴。