快速、基于酶促反应的方法：利用无细胞系统对微量线性模板进行扩增以实现蛋白质原型构建

本方案具有重要意义，因为它详细说明了如何利用从合成机构获得的小片段基因，快速制备大量可用于无细胞反应的DNA模板。滚环扩增技术比传统克隆方法能更快地生成大量DNA，因此可支持从合成DNA文库中实现更高通量的设计-构建-测试-学习循环。

由于这些技术涉及多个步骤且所需体积较小，初学者可能会遇到较大的固有变异性。应仔细注意操作技巧，熟练操作才能达到完美效果。首先，将 PCR 试剂盒中的所有组分加入一个单独的 PCR 管中。

然后加入1 µL重悬的基因片段。在中等转速下涡旋振荡5至10秒，轻轻混匀混合物。根据试剂盒生产商的说明书设置好PCR仪程序后，运行PCR反应。

PCR 完成后，使用 PCR 纯化试剂盒从反应混合物中纯化 DNA。在 1.5 毫升离心管中，按五比一的比例加入 DNA 结合缓冲液和 PCR 样品。将此混合物转移至离心柱中，在 16,000 ×g 条件下离心一分钟。

弃去流出液。向柱中加入 200 微升 DNA 洗涤缓冲液，在室温下孵育 1 分钟。再次离心柱子，并弃去流出液。

按照演示操作，用DNA洗涤缓冲液再次洗涤柱子。第二次洗涤后的流出液弃去，再将柱子离心额外1至2分钟，以去除残留的缓冲液。为洗脱DNA，将柱子转移至一个新的1.5毫升离心管中。

然后向柱中加入 46 µL 双蒸水。孵育 1 分钟后，通过离心将 DNA 收集到离心管中。使用分光光度计对纯化的 DNA 进行定量。

为了消化并环化DNA，将5微升所需的反应缓冲液、20单位的HindIII限制性内切酶以及45微升纯化的DNA加入PCR管中。使用移液器轻轻混匀该混合物，然后在37摄氏度的热循环仪中孵育15分钟。

孵育完成后，将反应体系在80摄氏度下孵育20分钟，以热失活HindIII酶。随后向新消化的DNA中加入5微升T4连接酶缓冲液和800单位T4连接酶。用移液器轻轻混匀后，在25摄氏度下孵育反应体系1小时，以完成环化反应。

反应完成后，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 DNA，方法如前所述。然后对 DNA 进行定量。进行滚环扩增时，将所有反应组分与 1 微升纯化的环化表达模板在单个离心管中混合。

用移液器将混合物充分混匀，并将10微升混合液分装到四个独立的离心管中。在30摄氏度下孵育4至18小时，然后在65摄氏度下孵育10分钟以热灭活酶。热灭活后，在12摄氏度下孵育5分钟，使管底产生冷凝。

接下来，向每根试管中加入15微升双蒸水，稀释所得溶液。在纯化和定量DNA之前，先混合每根试管中的内容物。进行无细胞反应时，将所需的各种组分加入试管中，并用双蒸水稀释至最终所需体积。

用移液器将一半溶液上下吹打10至20次，充分混匀。将反应混合物以15 µL等分量转移至微量滴定板中所需的孔中。然后用无色密封膜密封板子，以保持湿度并防止蒸发。

将密封好的酶标板放入酶标仪中，使反应进行至完成。若使用无细胞系统表达枯草杆菌蛋白酶BPN基因，需在平底无色96孔板中分装94微升双蒸水和1微升10微摩尔的PNA。然后加入5微升已完成的无细胞反应液，使用酶标仪在25摄氏度条件下，每隔20秒检测一次410纳米处的吸光度，持续10分钟。

在15微升反应体系中，仅使用3微升未纯化的RCA DNA，BL21 DE3 star提取物中超级折叠GFP的表达水平与PJL1质粒相当。将模板用量增加至两倍或三倍并未表现出明显优势，表明每反应3微升模板量已达到饱和。相反，在使用shuffle菌株细胞提取物时，增加RCA模板用量似乎具有促进表达的效果。

需要较低温度或较长折叠时间的蛋白质会影响完成整个实验流程所需的时间。例如，在表达四小时后检测枯草杆菌蛋白酶会导致失败的结果，因为四小时不足以完成枯草杆菌蛋白酶的成熟过程。然而，将反应时间延长至16小时后，则可检测到枯草杆菌蛋白酶的表达水平。

为使本实验方案达到最高效率，所有组分必须充分混匀。通过这些方法，可人工合成大量候选蛋白质文库，并以足够产量进行表达，从而用于表征分析。该方法为本课题组开发可在细胞裂解物中工作的NC双传感器奠定了基础，使我们能够快速表征原型蛋白质。

这将使我们能够更快速、更智能地迭代设计新的生物催化剂和治疗方法。