Echinococcus granulosus 棘球蚴小体的瞬时转导

细粒棘球绦虫的节片化形态的瞬时转染。我们描述了一种利用第三代慢病毒载体对细粒棘球绦虫不同发育阶段进行快速瞬时转导的技术。囊型棘球蚴病，又称包虫病，是由寄生于犬类肠道内的小型绦虫——细粒棘球绦虫引起的人畜共患寄生虫病中最为重要的疾病之一。

迫切需要开展应用遗传学研究，以阐明发病机制以及疾病防控的机理。然而，由于缺乏有效的基因评估系统，阻碍了对包括棘球绦虫属（Echinococcus species）在内的绦虫寄生虫功能遗传学的直接解读。相较于原生动物寄生虫，寄生性扁形虫的基因转移技术进展仍然十分有限。

在过去的二十年中，病毒递送系统已成为外源基因递送及基因/蛋白研究的重要工具。因此，我们评估了慢病毒介导的GFP报告基因对细粒棘球绦虫原头节和链体虫的瞬时转导效果。图1展示了针对细粒棘球绦虫不同发育阶段的研究方案示意图。

第一步，收集包虫囊肿。从屠宰场常规屠宰的自然感染绵羊肝脏中采集包虫囊肿。在吸出原头蚴之前，使用无菌纱布和70%酒精对囊肿表面进行彻底消毒。

吸取20至50 mL囊液至无菌的50 mL锥形管中。排尽液体后，用锋利的刀片切开包囊，将生发层转移至无菌的50 mL锥形管中，并短暂振荡以增加原头蚴的收集量。用PBS缓冲液洗涤原头蚴三至五次。

将原头蚴置于0.1%伊红溶液中染色5分钟，随后在光学显微镜下观察其活力。培养时应选用活力至少为95%的原头蚴。用2 mL胃蛋白酶处理原头蚴沉淀物，作用时间为15至20分钟。

为了分离单个原头蚴，将原头蚴沉淀物重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并通过两层无菌纱布过滤至新的无菌50 mL锥形管中。二、细粒棘球绦虫原头蚴的双相培养以获得成虫。向每个25平方厘米的培养瓶中加入10 mL液相培养基。

将约 5,000 个原头蚴加入培养瓶中，并将其转移至 CO2 培养箱。24 至 48 小时后，将原头蚴转移至含有固相的新培养瓶中，每瓶加入 1 mL 相同的新鲜液相培养基。将培养瓶放入培养箱，在 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养。

每五到七天，用新鲜的液体相培养基更换原有培养基。三、细粒棘球绦虫原头节的单相培养。确保在转导前 24 至 48 小时完成单相培养。

在25平方厘米的培养瓶中，用RPMI加10% FBS培养约5,000个原头节。将培养瓶置于CO2培养箱中，待用。四、用于病毒生产的细胞培养与制备。

将500,000个HEK细胞转移至一个含有5 mL DMEM的25平方厘米培养瓶中，DMEM中添加10% FBS、100 U/mL青霉素和100微克/mL链霉素。将HEK2细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育，并每48小时用完全培养基传代一次。最后使用低代次的HEK细胞进行转导。

五、使用第三代慢病毒载体进行病毒的生产与制备。第一天，将6孔培养板中的HEK细胞经胰蛋白酶消化后，每孔接种70,000个细胞，加入含10% FBS的新鲜无抗生素DMEM培养基。采用50%至60%融合度的细胞，通过磷酸钙法进行转导。

第二天，在实验开始前两到三小时，用含有2%胎牛血清（FBS）的新鲜无抗生素DMEM培养基替换细胞培养基。在1.5 mL离心管中，混合第三代慢病毒质粒，包括7微克/微升的pCDH513b转移载体、4微克/微升的PLPII、4微克/微升的PLPI以及2微克/微升的PMD2G辅助载体。向混合物中加入HEPES缓冲液，使总体积达到422微升。

向混合物中加入16微升1% TE缓冲液。向各管中加入62微升2.5 mL氯化钙溶液，并充分混匀。使用巴斯德移液管在1至2分钟内逐滴加入500微升2x HBS缓冲液至混合物中。

轻轻混匀，直至形成半透明溶液，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，将混合液缓慢加入每孔，并以缓慢的环形动作均匀分布。将培养板置于37摄氏度、5%CO2培养箱中孵育，4至6小时后更换为不含抗生素、含10%FBS的DMEM培养基。

第三天，使用倒置荧光显微镜确认瞬时转导是否成功以及细胞活力。第四天，通过收集每孔的上清液从培养基中收获病毒，并将其储存在负70摄氏度直至使用。六、利用该病毒对不同发育阶段的细粒棘球绦虫进行瞬时转导。

第一天，使用12孔培养板进行基因转导。用完全DMEM培养基将5,000至50,000个HEK细胞以三复孔形式培养，作为内参对照。将150个新鲜原头蚴以三复孔形式在RPMI加10% FBS培养基中培养。

将30条横裂期蠕虫以DMEM培养基和10%热灭活FBS进行三组平行培养。制备含有100万个病毒和4 µg/mL转染试剂的混合液，用于转导HEK细胞及蠕虫的不同发育阶段。将该混合液缓慢加入每块培养板中，并以缓慢的环形动作使其均匀分布。

将培养板置于 CO2 培养箱中孵育 4 至 6 小时，条件为 37 摄氏度、5% CO2。每份样品更换为相同的完全培养基，以尽量减少转染试剂的毒性作用。第二天，重复前两个步骤，以提高 HEK 细胞、原头蚴和链状节片虫的瞬时转导效率。

将所有培养皿在 CO2 培养箱中孵育 24 至 48 小时，培养条件根据细胞培养基类型保持一致。第三天，通过荧光显微镜观察以确认转导是否成功。代表性结果。

本文介绍了一种利用第三代慢病毒载体在细粒棘球绦虫中进行快速高效瞬时转导的技术。根据我们之前的研究，将原头节在双相培养基中培养，以获得链节化虫体。原头节经过六周的体外培养后发育为链节化虫体。

在双相培养基中观察到细粒棘球绦虫的不同发育阶段，包括内陷的原头节（图2A）、外翻的原头节（图2B），以及具有第一和第三节片形成的链体虫（图2C至E）。分别从单相和双相培养获得的原头节和链体虫通过表达GFP的慢病毒进行转染（图3）。作为瞬时转导过程的对照，HEK细胞明显表达了GFP。成虫在皮层结构中表现出最清晰的GFP表达。

然而，原头蚴在转染后48小时表现出相对较低的GFP表达水平。部分原头蚴周围存在的囊液残留物或生发层碎片导致转染样本中出现一定的荧光背景。HEK细胞和节片化虫体的荧光强度在24小时和48小时后均有所增加。

了解线虫和扁形动物生物学的分子基础是人畜共患寄生虫致病性研究中最重要的前沿领域之一。缺乏有效的基因评估系统是直接解读绦虫寄生虫（包括棘球绦虫属物种）功能遗传学的主要障碍。本研究的主要目标是阐明慢病毒载体转导的过程，该过程将在未来的棘球蚴病研究中发挥关键作用。

结果表明，节片型虫体对基因瞬时转导的响应性高于原头节，这可能是由于节片型虫体具有更复杂的体被结构所致。然而，由于慢病毒转导的特性，多细胞结构的原头节和节片型虫体中的荧光强度通常远低于单层 HEK 细胞。目前迫切需要在基因组和转录组水平上开展针对棘球绦虫以及多种寄生性和自由生活的扁形动物模式系统的应用遗传学研究。

因此，开发针对绦虫的基因转移技术，为病毒介导的基因定位或CRISPR-Cas9基因编辑等新技术的潜在应用铺平了道路。本研究在绦虫模型中实现了慢病毒转导，并展示了具有前景的结果，可能对扁形动物生物学研究产生重要影响。然而，仍需开展更深入的研究，以优化方法并拓展这些技术在未来实验中的适用性。