将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染入 N. gruberi 滋养体

本研究是理解闭合环状染色体外核糖体DNA元件（CERE）中哪些序列对于其复制至关重要，以及阐明CERE的DNA复制机制的第一步。本实验方案填补了目前对CERE在格氏耐格里变形虫（naegleria gruberi）中传播机制及其有效传播所需元件认知上的空白。我们的实验方案提供了一种简约的耐格里变形虫转染方法，旨在减少可能干扰细胞正常状态的操作步骤。

因此，本研究探讨了CERE在格氏耐格里变形虫（naegleria gruberi）中的传播机制，以及CERE中哪些组分对其有效传播至关重要。我们已证实，不同耐格里虫（naegleria）物种含有独特的CERE，其序列长度和核苷酸组成均存在差异。本研究旨在为分析耐格里虫属内各物种CERE的分子动态特征奠定基础。

我们的研究结果为进一步探究CERE复制所需的组分以及ORI是否可用于在棘阿米巴属物种中扩增外源构建体等问题奠定了基础。我们计划将研究拓展至棘阿米巴属的其他物种，以阐明CERE在种内水平的转染特性。首先，将冻存的格氏棘阿米巴滋养体置于37°C下孵育3分钟。

将滋养体在 PYNFH 培养基中于 25 摄氏度培养至约 80% 汇合。将汇合的培养瓶置于冰上 5 至 10 分钟，以使贴壁的滋养体从塑料表面脱落。然后轻轻摇晃培养瓶，使残留的贴壁细胞脱落。

用无菌包囊培养基替换原有培养基，以诱导格氏耐格里原虫细胞形成包囊。48小时后，从培养瓶中收集包囊。在4°C条件下，以600×g离心10分钟，收集包囊。

离心后，将包囊重悬于含有10%胎牛血清的2毫升PYNFH培养基中，以诱导细胞脱囊。于25°C孵育包囊72小时，直至滋养体孵出并达到80%汇合度。转染滋养体时，先将1毫升滋养体接种至6孔平底组织培养板中。

接下来，将质粒转染试剂混合物在室温下孵育10分钟。在转染前，从滋养体单层中吸出约800微升培养基。然后向滋养体中加入200微升质粒转染试剂混合物。

每15分钟轻轻摇晃培养板一次，以防止培养基在板边缘聚集并干燥。一小时后，将10单位的DNAs加入1毫升10X DNAs缓冲液中，并将其添加至各孔中。将培养板在37°C下孵育15分钟，以去除残留的质粒DNA。

现在用一毫升培养基将培养板洗涤一次，然后加入两毫升新鲜培养基。将培养板置于25°C条件下孵育24至36小时。

孵育完成后，将一个孔中的内容物以1:2的比例分装至新培养板中。随后收集其余孔中的滋养体用于进一步分析。在标准培养条件下，格氏耐格里变形虫（Naegleria gruberi）滋养体呈阿米巴样形态，并贴附于培养瓶壁生长。

冰上孵育后，滋养体呈圆形且不贴壁。在包囊培养基中孵育滋养体可使其形成包囊。首先，向含有转染的格氏耐格里变形虫滋养体的试管中加入200微升100毫摩尔的氯化钠溶液。

在4°C条件下，以600G离心10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于100微升100毫摩尔EDTA中。将离心管置于98°C的加热块中15分钟，以裂解细胞。

将离心管在4°C、最大转速下离心10分钟，以沉淀杂质。将上清液转移至新的离心管中。接着，向上清液中加入0.5倍体积的乙酸铵、3倍体积的无水乙醇以及1微升的糖原。

将离心管颠倒数次以混匀，然后在零下80摄氏度条件下孵育30分钟或过夜。孵育结束后，在室温下以16,000G离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀物，加入200微升70%乙醇洗涤沉淀，随后再次离心。

将干燥的沉淀重悬于无菌去离子水中，调整滋养体密度至每微升10,000个滋养体。用针对转染DNA的特异性引物进行PCR并检测转化后的滋养体后，向CERE样品中加入2微升6X上样缓冲液。然后将加样后的样品上样至0.8%琼脂糖凝胶中。

电泳1.5至2小时后，将凝胶置于含有100毫升去离子水的DNA染料中孵育。将染色后的凝胶转移至去离子水中浸泡20分钟以脱色。使用紫外光成像系统观察凝胶并记录结果。

PCR 分析显示，pGRUB 在转染的滋养体中至少经过七次传代后仍可被检测到。pGEM 在第一次传代后即丢失，表明空质粒未被阿米巴保留。