小细胞外囊泡的分离及其树突状细胞摄取 细粒棘球绦虫

我们的研究聚焦于细粒棘球绦虫分泌的细胞外囊泡的特征及其在寄生虫-宿主相互作用中的作用。我们探讨了这些囊泡被宿主树突状细胞摄取的情况及其对免疫调节的潜在影响。我们已证实，细粒棘球绦虫的细胞外囊泡可被树突状细胞摄取，进而影响其成熟过程及抗原呈递功能。我们还鉴定了囊泡内容物中的关键免疫调节蛋白和抗原蛋白，这些蛋白可能影响寄生虫与宿主之间的相互作用及免疫应答。

本方案优化了体外寄生虫培养条件，以增强小型细胞外囊泡（small EV）的产生，确保高质量的分离，并整合树突状细胞实验以研究免疫调节作用。该方案可整体或部分应用。我们未来的研究将探讨细粒棘球绦虫（E. granulosus）来源的细胞外囊泡对免疫反应的体内效应、其作为疫苗组分的潜力，以及其对树突状细胞、巨噬细胞及这些细胞免疫模型的影响。

[旁白] 首先，使用70%酒精清洁因包虫病安乐死的小鼠腹侧表面。手术切开腹腔，用剪刀和镊子取出已发育的棘球蚴。然后用镊子将棘球蚴团块转移至无菌培养皿中。如有需要，使用镊子去除结缔组织，使囊泡从棘球蚴团块中释放出来。用含补充剂的PBS在4°C下清洗所获得的棘球蚴。现在，使用所有必需组分配制培养基，并通过轻柔颠倒混匀溶液。将5毫升配制好的培养基转移至每个Leighton管中。将寄生虫加入培养基中，并在37°C下孵育5天，期间不更换培养基。从每个Leighton管中收集寄生虫培养上清液，并转移至15毫升锥形离心管中。在4°C下以300×g离心10分钟，将上清液转移至新的15毫升锥形离心管中。接着，在4°C下以2,000×g离心10分钟。使用移液器将所得上清液转移至新的1.5毫升离心管中。在4°C下以10,000×g离心30分钟，以去除较小的细胞碎片。使用移液器将上清液转移至适合超速离心转子的离心管中。用记号笔标记管壁一侧，并将离心管放入转子中，使标记侧朝上。在4°C下以100,000×g离心1小时。迅速倒出上清液，将离心管倒置静置1分钟。用至少3毫升PBS洗涤沉淀，以去除污染蛋白。使用移液器沿离心管内壁反复吹打重悬沉淀，重点处理预计沉淀位于的标记侧。重复超速离心后，将沉淀重悬于30微升PBS中。将重悬的样品转移至1.5毫升离心管中，并将细胞外囊泡在-80°C下冷冻保存。在将5至8周龄雌性CF-1小鼠安乐死后，先用乙醇喷洒其体表，再将其放入组织培养超净台中。将小鼠仰卧位放置于解剖板上。使用镊子和解剖剪，在尿道上方做垂直T形切口，并向两侧下肢顶端水平延伸。用镊子沿后肢两侧分离皮肤，暴露腿骨及周围组织。用手从踝部向腹部方向推挤，将每条腿的皮肤拉至对侧，使双侧腿部完全去皮。现在，使用剪刀和镊子小心取出股骨和胫骨，确保骨骼不发生断裂。用镊子夹住每根骨骼的末端，剪断肌腱以去除骨骼周围的肌筋膜。用纸巾彻底清理残留的肌肉组织。将每根取出的骨骼放入含有2毫升含补充剂的完全RPMI培养基的无菌50毫升离心管中，以去除碎片。弃去培养基后，用70%乙醇洗涤骨骼两次，每次5分钟。将洗涤后的骨骼转移至无菌培养皿中，使用锋利的解剖剪剪除两端骨骺，以暴露骨髓细胞。使用连接在含完全培养基的20毫升注射器上的25号针头，小心冲洗四根骨骼中的骨髓细胞，使其流入无菌培养皿中。然后通过移液轻柔均质化含有骨髓细胞的培养基，以去除骨结缔组织和细胞团块。将样品转移至无菌50毫升锥形离心管中，使细胞通过无菌70微米聚丙烯细胞滤器，以去除结缔组织和骨碎片。在4°C下以450×g离心7分钟。小心移除并弃去上清液，确保沉淀仍附着于管壁。将细胞在室温下孵育1分钟后，用500微升红细胞裂解缓冲液重悬细胞，并加入3毫升完全培养基中和裂解缓冲液。在4°C下以450×g离心7分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于5毫升完全培养基中。按上述方法过滤样品后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。向培养基中添加300纳克/毫升重组小鼠FMS相关酪氨酸激酶3配体（FLT3L）。将细胞以每毫升1×10⁶个细胞的浓度接种至多孔板中。在37°C、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育7天。第3天时，从每孔中移除1毫升培养基（不扰动细胞），并补充1毫升预温的新鲜完全培养基，其中含150纳克/毫升重组小鼠FLT3L。从细粒棘球绦虫幼虫期纯化的细胞外囊泡（EVs）主要为小EVs，粒径范围为50至200纳米，经动态光散射和透射电子显微镜确认。骨髓来源的树突状细胞在7天内表现出形态学分化，从最初的小型圆形造血细胞逐渐转变为具有胞质突起的星状细胞。孵育1小时后，树突状细胞摄取了荧光标记的小EVs，共聚焦显微镜显示这些EVs与内体-溶酶体区室中的MHCII分子共定位。