三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜成像

本方案采用超分辨率显微技术，具体为直接随机光学重建显微镜（dSTORM），以突破衍射极限，实现细胞外囊泡（EVs）在三维空间中纳米级精度的可视化。dSTORM 的一个显著优势在于，无需进行破坏性处理即可直接观察光衍射极限以下的颗粒，从而避免改变 EV 的生化特性。许多进化上不同的病毒利用 EV 进行信号传递，因此 dSTORM 可用于表征 EV 中的疾病生物标志物及其进展过程，同时可用于可视化单个病毒颗粒（如 SARS-CoV-2）。首先，将亲和纯化的细胞外囊泡（EVs）加入总反应体积为 200 微升的玻璃底八孔微孔板中，并在 4 摄氏度条件下孵育过夜，使其贴附于表面。

无需从八孔板中移除现有溶液，通过向每孔含EV的溶液中加入200微升4%多聚甲醛（溶于1×PBS），将EV固定在板上，并在室温下孵育30分钟。使用微量移液器小心移除多聚甲醛及过量溶液，避免扰动EV。用1×PBS洗涤EV，以去除多余的多聚甲醛。

洗涤步骤重复进行三次。去除多余的1× PBS。按照生产商的说明书，通过将5毫摩尔原儿茶酸双加氧酶稀释于成像缓冲液中，为每个样品制备250微升dSTORM Bcubed缓冲液溶液。

根据制造商的说明书，向每个孔中加入 250 微升已配制好的缓冲液，并在成像前于室温孵育 20 分钟，以清除氧化性分子。EVs 可立即进行观察，或在 4 摄氏度保存一周。为准备用于超分辨率显微镜校准的微珠，将 100 纳米微球用分子生物学级水稀释至 0.5% 的浓度，然后将 200 微升移液至玻璃底微型八孔板的每个孔中。

将珠子在室温下静置1小时，使其沉降到各孔底部。不移除现有溶液，向每孔的校准珠溶液中加入200 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育30分钟。用微量移液器小心吸除多聚甲醛溶液，避免扰动珠子，并用1×PBS洗涤珠子3次。

按照文中的描述制备缓冲液。移除1X PBS，向每孔加入250 µL已制备的缓冲液。在观察前让缓冲液静置20分钟。

在将样品放置于载物台之前，先使用“连接显微镜”按钮连接至三维显微镜。在物镜上添加100倍镜油，并将孔的中心置于物镜上方。在“采集”设置中，打开473纳米和640纳米激发激光器，然后点击“查看”。

在不激活3D镜头的情况下，通过点击“图像显示选项”中的“光子计数”，在光子饱和设置下观察微珠。将473纳米激光器的初始激光功率设为8.4毫瓦，640纳米激光器的初始激光功率设为11.6毫瓦。将激光焦点降低至约负300纳米，或调整至校准微珠的焦平面，以获得单个微珠的清晰分辨率。

Z平面聚焦后，进一步调整激光功率水平，以补偿每个视野之间的差异。在仪器功能下，完成3D映射校准和通道映射校准，以获取X、Y和Z轴上的误差。在通道映射校准期间，将最大视野数设为20，目标点数设为4,000，通道间最大距离设为5.0像素，通道间排除半径设为10.0像素。

确保校准产生的点覆盖率达到90%以上，且成像质量良好。保存当前校准数据，供后续图像采集使用。在物镜上添加100倍镜油，将制备好的EVs样本置于显微镜载物台上。

不启用3D镜头，打开640纳米激发激光，根据视野中信号强度将激光功率初步调至1.2至12.5毫瓦之间，以激发红色膜染料标记的细胞外囊泡（EVs）。在“图像显示选项”中，将观察方式从光子饱和切换为百分位数，以便更清晰地观察EVs。调节激光功率，在最大化信号的同时尽量减少噪声，并保持所有其他参数不变。

通过点击 Z 轴上的向上或向下图标来调整 Z 平面的焦距。根据信号强度和视野范围，将曝光时间设置为 20 毫秒，帧采集数设置为 10,000 帧，初始激光功率设置在 1.2 至 12.5 毫瓦之间。使用图标激活 3D 镜头，然后点击“采集”按钮开始数据采集。

在整个图像采集过程中，每采集1000帧图像，将激光功率分三个阶段逐步增加10，或增加至足以维持高信噪比的水平。采集过程中不得调整Z平面。图像采集完成后，切换至分析查看窗口。

对未滤波图像执行漂移校正，然后启用滤波器。根据论文所述，调整光子计数、定位精度、sigmas 和帧索引。沿视场中单个EVs的X轴叠加X、Y、Z平面视图工具，并导出光开关事件的单个csv文件。

使用线性直方图工具，在X乘Y的视场中沿X轴和Y轴对单个细胞外囊泡（EV）进行分割，将光开关事件归入设定的距离组。拍摄单个EV的图像，并将其保存为tif文件。利用三维可视化工具创建单个EV的三维视频，并根据其在Z轴上的位置进行着色。

在对显微镜进行校准后，其在X、Y轴方向的平均误差为16纳米，Z轴方向为38纳米。利用该系统成功实现了对纯化的u20s EVs的可视化，其分辨率在X、Y轴方向可达20纳米，Z轴方向可达50纳米。通过dSTORM技术获取的三维图像中，在10,000帧的曝光过程中，随着激光功率的增加，单个EVs呈现出光控开关现象，并在所获得的图像中清晰可见。对采集后的图像进行Z平面校正，并结合光子计数、sigma值及定位精度分析，最终实现了EVs三维结构的清晰分辨。

如右上角图例所示，该EV仅在前7,000帧中发生了光转换。直方图证实，大多数光转换事件发生在100纳米半径范围内，表明所观察到的EV为外泌体，且小直径EV的分离成功。利用线直方图工具和X、Y、Z平面视图工具对其他单独追踪的EV进行的粒径分布分析也证实，大多数光转换事件均发生在中心100纳米半径范围内。

Z轴方向的误差增大，导致囊泡沿轴向的最终成像被拉长。光转换事件与囊泡大小无相关性，表明基于dSTORM的表征方法可用于直径小于100纳米的外泌体及小型包膜病毒等小型囊泡。进行dSTORM实验时，需注意将初始激光功率设置得非常低，并在图像采集过程中缓慢升高，以防止光漂白。

自开发以来，dSTORM 技术使研究人员能够更深入地理解亚细胞结构的形态，这些结构由于传统光学显微镜的衍射极限而一直无法被清晰观察。