毛细管电泳电喷雾电离质谱法对肌醇焦磷酸的绝对定量
2021年8月13日
本文描述了一种用于对哺乳动物细胞提取物中的肌醇焦磷酸盐进行绝对定量的毛细管电泳-电喷雾电离质谱分析方法。
该方法为我们迄今为止测试的所有生物体中的肌醇磷酸代谢提供了高质量的结果。它还将揭示我们目前尚未认知的新的细胞生物合成途径。通过毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）分析肌醇磷酸代谢具有更快的速度、高度的灵敏性，并能够提供肌醇磷酸分子组装的结构信息。
首先，建立毛细管电泳-电喷雾电离质谱联用（CE-ESI-MS）系统，该系统由商用毛细管电泳仪和配备安捷伦喷射流电喷雾离子源（Agilent Jet Stream ESI source）的三重四极杆串联质谱仪组成。接着，连接鞘流液1:100分流器与等度液相色谱泵的出口，并确保毛细管电泳系统进样瓶与质谱分析器的喷雾尖端处于相同高度。然后，使用MassHunter Workstation软件或类似质谱软件，控制整个系统并进行数据采集与分析。
配制好毛细管电泳运行缓冲液和鞘液后，以每分钟5毫升的流速冲洗5分钟来安装鞘液。然后将流速设置为每分钟1毫升，泵压设置为180 bar。确保回收管路重新连接至鞘液瓶，以重复利用溶剂。
接下来，使用带有旋转金刚石刀片的毛细管切割器，正确切割毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）毛细管两端带有紫外检测窗口的部分。然后用打火机去除两端约两到三厘米的聚酰亚胺涂层，并用异丙醇清洁毛细管表面。安装毛细管时，将其准确插入CE-MS卡匣中。
然后单击“更换卡盒”按钮，并将卡盒安装到毛细管电泳（CE）设备中。为活化毛细管，首先用1摩尔的氢氧化钠冲洗毛细管，随后用水冲洗10分钟，再用CE运行缓冲液冲洗15分钟。接下来，将毛细管插入CE-MS喷雾头中。
使用放大镜和喷雾器上的调节螺丝，精确调整毛细管出口，确保毛细管末端从喷雾器尖端突出约 0.1 毫米。在全扫描模式下检查电喷雾离子源的稳定性，总离子电泳图的波动应控制在 5% 以内。随后，使用肌醇磷酸标准品进行一次测试运行。
配制内标混合物后，取10微升样品与0.5微升内标混合物混合，并加入毛细管电泳样品瓶中。使用补液系统时，点击“更换瓶子”按钮。将配制好的250毫升毛细管电泳运行缓冲液加入电解质瓶中。
然后点击“清洗管路”，同时将补充针保留在装有水的小瓶中。设置电喷雾电离（ESI）和质谱（MS）参数。使用含肌醇多磷酸标准品混合物的源优化工具优化源参数，并利用MassHunter优化软件对所有标准品进行多反应监测（MRM）条件的优化。
接下来，对肌醇磷酸提取物进行检测运行并检查结果。当样本较多时，设置序列。测量结束后，让质谱仪保持待机模式，不要关闭液相色谱泵。
当无鞘液供应时，将 CE-ESI-MS 喷雾器更换为 LC-ESI-MS 喷雾器。进行数据分析时，打开定量分析软件，并为所有样品创建一个批处理。接着，根据获得的多反应监测数据创建新方法，并将碳-13标记的肌醇磷酸盐设为内标物。
然后，检查多反应监测化合物、保留时间、内标物、浓度和定性离子参数设置。通过验证后退出，将该方法应用于当前批次。保存该方法。
然后检查批处理中的每个峰是否已正确积分。若未正确积分，则需手动进行峰积分。将结果导出至电子表格，并通过比较阳极液峰响应与已知浓度的稳定同位素标记内标物的相应峰响应，对肌醇焦磷酸进行定量。
最后，根据肌醇磷酸提取液中测得的浓度及其体积，计算其绝对含量，并进一步通过细胞数量或蛋白含量进行归一化处理。根据细胞计数和HCT116细胞的平均细胞体积，计算细胞内浓度。此处显示的是浓度为2微摩尔的肌醇焦磷酸标准品的提取离子电泳图。
哺乳动物中肌醇焦磷酸盐的代谢及其简化结构如图所示。此处展示了来自伦敦大学学院（UCL）的HCT116细胞的毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）检测结果。采用CE-MS技术定量分析了来自UCL与美国国立卫生研究院（NIH）的HCT116细胞之间IP8水平的差异。
来自UCL的HCT116细胞中IP8的水平比来自NIH的细胞高出七倍。HCT116 UCL细胞中1,5-IP8的显著积累伴随着1-IP7的明显增加。对NIH来源的HCT116细胞进行氟化钠处理后的CE-ESI-MS分析显示，5-IP7水平升高，同时IP6减少，并出现5-PPIP4。
尽管1-IP7的水平在氟化钠处理的细胞中有所降低，但并未完全消失，大多处于检测限以下。形成稳定的CE-ESI-MS级至关重要。我们建议在测量前检查系统的重复性和灵敏度。
该技术可用于研究肌醇磷酸代谢、植入物及组织，同时也为深入研究具有重要生物学意义的肌醇焦磷酸提供了机会。
概述
本文介绍了一种利用毛细管电泳电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）定量哺乳动物细胞提取物中肌醇焦磷酸盐的实验方法。该方法具有快速、灵敏度高以及能够提供肌醇磷酸盐结构信息的优点。
关键研究组成部分
科学领域
- 质谱分析
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 肌醇焦磷酸盐在细胞信号传导中发挥关键作用。
- 了解其代谢过程有助于深入认识多种生物学过程。
- 毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）提供了一种快速且灵敏的分析方法。
- 以往的方法在效率和细节方面均不及CE-ESI-MS。
研究目的
- 建立一种可靠的肌醇焦磷酸盐定量方法。
- 分析哺乳动物细胞中肌醇磷酸盐的代谢过程。
- 探究不同细胞系中肌醇焦磷酸盐水平的差异。
使用的方法
- 使用特定设备配置搭建 CE-ESI-MS 系统。
- 制备 CE 运行缓冲液和鞘液。
- 冲洗并活化毛细管以获得最佳性能。
- 使用 MassHunter 软件进行数据采集与分析。
主要结果
- 毛细管电泳-电喷雾质谱法（CE-ESI-MS）成功定量了HCT116细胞中的肌醇焦磷酸水平。
- 不同来源的HCT116细胞之间，IP8水平存在显著差异。
- 氟化钠处理引起了肌醇磷酸代谢的变化。
- 该方法表现出良好的重复性和高灵敏度。
结论
- 毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术（CE-ESI-MS）是研究肌醇磷酸代谢的有力工具。
- 该技术有助于加深我们对细胞生物合成途径的理解。
- 未来应用可能包括在多种生物学背景下对肌醇磷酸进行更广泛的研究。
常见问题
行业重要性概述
准确测定肌醇焦磷酸盐（PP-InsPs）可通过提供磷酸盐稳态和细胞能量状态的定量读数，从而在靶点验证中实现机制层面的风险评估。该毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS）可支持细胞内信号通路相关检测方法的开发，实现区域异构体的基线分离并提供绝对浓度数据。该方法通过在实验条件下对PP-InsPs进行时间序列监测，提高了早期发现阶段的预测可信度，有助于临床前模型选择中的决策判断。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够验证将焦磷酸肌醇（PP-InsPs）与代谢信号传导及胰岛素敏感性通路相关联的治疗假说。
- 操作价值：无需使用放射性示踪剂，即可实现对低丰度PP-InsPs的高通量、高灵敏度定量，降低检测复杂性和成本。
- 预测价值：通过提供PP-InsPs（包括次要异构体）的绝对细胞浓度，支持生物学层面的风险评估，助力靶点信心判断。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：实现PP-InsP区域异构体的基线分离，能够在哺乳动物细胞中特异性检测具有生物学意义的分子种类。
- 操作价值：通过稳定同位素标记的内标提供可重复且定量的检测结果，确保不同实验批次间的分析标准化。
- 可扩展性：便于在与疾病相关的体系中，重复使用该平台筛选化合物对肌醇磷酸代谢的影响。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过监测实验条件下（如氟化钠处理）HCT116 细胞中 PP-InsP 动态的时序变化，将发现阶段的 PP-InsP 研究与临床前验证相连接。
- 机制去风险化：揭示 IP7/IP8 水平的变化及 PPIP4 的出现，支持通路特异性生物标志物的匹配以及基于风险评估的推进决策。
- 疾病相关体系：适用于在肿瘤学和代谢性疾病模型中研究磷酸盐稳态和细胞能量状态。
流程与工作流整合
该方法通过提供可定量且具有结构解析度的PP-InsP数据，阐明其作用机制并支持检测方法的建立，从而整合到从靶点验证、先导化合物鉴定直至临床前评价的完整发现流程中。
- 发现生物学：通过定量检测作为代谢信使的焦磷酸肌醇（PP-InsPs），监测磷酸盐稳态和胰岛素敏感性，支持假设验证与信号通路解析。
- 筛选：通过高灵敏度检测和PP-InsPs的基线分离，实现检测就绪，可在代谢信号通路检测中可靠评估化合物活性。
- 分析学：利用多反应监测（MRM）提供定量因变量测量结果（绝对浓度、时间变化），实现不同条件和细胞系间的统计学比较。
- 转化研究：通过在疾病相关体系中监测PP-InsPs的调控，连接临床前研究的连续性，支持生物标志物匹配和基于风险的决策制定。
- 企业级复用：建立可重复使用的毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）能力，用于跨多个项目和治疗领域的肌醇磷酸代谢的纵向研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过焦磷酸肌醇（PP-InsPs）的绝对定量实现可预测的置信度，降低肌醇磷酸盐信号通路中的机制模糊性。
- 操作价值：采用毛细管电泳-电喷雾电离质谱法（CE-ESI-MS），结合内标归一化和优化的离子源参数，实现方法的标准化、可重复性和高灵敏度。
- 战略价值：通过定量的PP-InsP检测结果支持更优的立项或终止决策，避免使用放射性方法以提高资本利用效率，并通过早期通路去风险化降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于PP-InsP调控数据进行风险校正后的优先级排序，推动影响磷酸盐稳态和能量信号通路的化合物进入下一阶段研发。
实施注意事项
- 需要具备毛细管电泳、质谱优化以及使用稳定同位素标记标准品进行代谢物定量方面的专业知识。
- 需要配备商用毛细管电泳系统、配备安捷伦喷射流电喷雾离子源的三重四极杆质谱仪，以及用于数据采集与分析的MassHunter软件。
- 要求跨团队统一毛细管电泳运行缓冲液的配制、鞘液流速（1 mL/min）和毛细管安装流程，以确保电喷雾离子源信号稳定性（总离子流波动小于5%）。
- 涉及针对不同类型样本（细胞、组织）的适应性调整，需根据细胞数量或蛋白含量进行归一化处理，并选择合适的内标物。
- 包含实际应用中的局限性，例如测量前需进行系统重复性和灵敏度检查，以及在方法开发过程中可能受到高丰度肌醇磷酸盐的干扰。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry (CE-ESI-MS) System
1:38
Preparation of Buffer, Capillary, and CE-MS System
3:28
Performing the CE-ESI-MS Runs
5:10
Data Analysis
6:50
Results: Quantitation of Inositol Pyrophosphates from Mammalian Cell Extracts by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry
8:35
Conclusion
