通过毛细管等电聚焦方法对蛋白质及其亚型进行高灵敏度定量检测

该方法有助于回答生物医学研究领域中的关键问题，例如生物标志物发现、药物研发、诊断以及药物或抗体的筛选。该技术的主要优势在于其高通量特性，能够以高度可重复的方式检测蛋白质异构体。该技术的应用前景广泛，可用于多种疾病的诊断，因为它能够检测受疾病影响的蛋白质或其异构体。

尽管该方法可用于研究细胞信号通路，但也可应用于其他需要分析特定蛋白质的系统。由于实验步骤中包含去除气泡、加样到孔板等技巧，难以掌握，因此对该方法的可视化演示至关重要。首先，通过将1微升DMSO抑制剂混合液和2微升蛋白酶抑制剂加入47微升样品稀释液中，配制样品稀释液混合液，使DMSO和蛋白酶抑制剂的终浓度为1 X。使用该样品稀释液混合液稀释先前分离的蛋白裂解液，以获得所需的蛋白浓度。

接下来，将 3.325 µL 的等电点标准品梯度、6 µL 蛋白酶抑制剂和 3 µL DMSO 抑制剂加入 137.675 µL 的 Antholite 预混液中。涡旋混匀样品至少 15 秒，并置于冰上保存。将上述两种制备好的溶液按 1:3 的比例混合，使 DMSO 蛋白酶抑制剂和等电点标准品梯度的终浓度均为 1×，同时使毛细管中的蛋白质达到预期的最终浓度。

加入蛋白质到样品混合物后，所有步骤均需在冰上或4摄氏度条件下进行。将一块384孔板放置在冰上。根据自动Western印迹系统软件设计的检测模板布局，向板中的相应孔加入10 µL样品混合物。

随后，用抗体稀释液稀释一抗和二抗。然后，向每个孔中加入10 µL一抗和15 µL二抗。接下来，将发光剂（luminol）和过氧化物XDR按1:1的比例混合。

向每个孔中加入15微升鲁米诺过氧化物混合液。待样品和试剂加入到板中后，在4摄氏度、2500 × g条件下离心10分钟，以沉淀液体并去除气泡。若仍有气泡存在，可用细小的移液器吸头手动去除。

打开全自动 Western 杂交系统软件，从文件菜单中点击“新建”。进入布局面板，在 384 孔板中为试剂和样品指定位置。通过单击任意一个孔块中的孔来完成试剂的分配。

选择一个包含12个孔的行区块。接着，转到布局窗格工具栏，插入一个样本、一抗、二抗或鲁米诺行区块。进入方案窗格，选择试剂在板上的位置。

然后，点击样本列中的单元格，并从下拉菜单中选择试剂。以相同方式，为每个循环选择一抗、二抗和鲁米诺的试剂位置。依次点击一抗或二抗列中的各个单元格，并根据需要修改孵育时间。

然后，在方案部分点击“添加”按钮以增加循环步骤。在模板窗格中，输入与样品相关的信息，例如一抗和二抗的名称、目录编号及其稀释比例。保存新的检测文件。

点击“开始”按钮前，请快速检查布局，确保所有设置正确无误。现在，点击“开始”以启动运行。软件将提示用户移除废液，重新加注水和毛细管盒，向试剂槽中添加阳极液和阴极液，加入洗涤缓冲液，并将微孔板加载到冷却的样品托盘中。

运行开始几分钟后，计算机屏幕上将显示仪器状态栏。单击运行摘要界面以查看状态和分离窗格。要观察毛细管中的电泳分离过程，请在控制面板中先单击选择所需的循环，然后单击播放按钮，播放该毛细管的分离动画。

打开运行文件，选择分析界面选项卡。点击“编辑”，然后选择“分析”以更改等电点范围。应用相应的等电点标准。

添加峰拟合，并命名峰。最后，在峰标签中选择要使用的数据，并导出数据以进行进一步分析。此处显示的是经血管内皮生长因子刺激的裂解液中磷酸化细胞外信号调节激酶的电泳图谱。

使用血管内皮生长因子处理后，观察到磷酸化蛋白的诱导水平非常高。插图显示了内源性上样对照 HSP 70，表明未处理和处理样本的上样量相似。在传统的免疫印迹实验中，仅检测到两条条带，而毛细管等电聚焦分析则将磷酸化的细胞外信号调节激酶蛋白分离为四个峰。

此处显示的是经血管内皮生长因子刺激的裂解液中细胞外信号调节激酶的电泳图谱。插图显示了平行实验中使用的相同上样对照。传统的免疫印迹仅显示两条条带，分别对应于细胞外信号调节激酶1和细胞外信号调节激酶2。

采用毛细管等电聚焦技术时，细胞外信号调节激酶蛋白被分离为六个峰，分别对应四种不同的磷酸化形式峰和两种非磷酸化形式峰。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数小时内完成，具体时间取决于循环次数。在进行该实验时，需注意使用比常规免疫印迹更高的抗体浓度。

该方法的可视化演示至关重要，因为实验步骤中包含一些技巧（例如去除气泡、加样到孔板等），难以通过文字描述掌握。观看本视频后，您将能够充分理解如何设计实验、准备样品、运行检测以及分析数据，从而观察目标蛋白的不同亚型。