真核生物多聚核糖体图谱分析

本实验的总体目标是从细胞裂解液中分离并比较单核糖体和多核糖体组分。首先培养目标细胞以完成第一步，实验的第二步是制备细胞裂解液。

该实验步骤的第三步是将裂解液通过蔗糖梯度离心。最后一步是分段收集梯度组分，并通过紫外吸收曲线来观察不同的核糖体群体。最终，可通过多核糖体图谱分析获得结果，以显示在不同实验条件下翻译水平的变化。

大家好，我是 Anthony Esposito，来自马里兰大学（UMD）及罗伯特·伍德·约翰逊医学院（R-W-J-M-S）分子遗传学、微生物学与免疫学系 Terry Goss Kinsey 博士实验室。我是 Marcus Lewis，同样来自 R-W-J-M-S 的 McKinsey 实验室。

今天我们将向您展示一种多聚核糖体分析的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究由基因突变或环境因素引起的蛋白质合成变化。那么，让我们开始吧。蔗糖。

梯度液应在使用前一天配制，以使梯度充分连续。取适量体积的7%和47%蔗糖储备液，配制下列每种蔗糖浓度的溶液各48毫升：7%、17%、27%、37%和47%。向每种蔗糖溶液中加入1 mol/L的DTT，使其终浓度为1 mmol/L。为便于倾注梯度液，将一根意大利面移液管通过Parafilm封口膜固定并密封连接至20 mL注射器上。

在一根直径1英寸、长3.5英寸的聚丙烯超速离心管底部加入7 mL的7%蔗糖溶液。接着，将巴斯德移液管的管尖置于管底附近，缓慢加入7 mL的17%蔗糖溶液，使其位于7%蔗糖溶液下方。每层溶液的加入时间应不少于20秒。

当梯度制备完成后，分别用 7 毫升的 27%、37% 和 47% 蔗糖溶液重复操作。应观察到各层之间有清晰的分界线，表明混合程度最小。将所有梯度连同转子、收集样品所用的瓶子和试管一起在 4°C 下过夜保存。

为了制备酵母细胞的提取物，首先将100个25毫升的酵母培养液培养至OD 600为0.8至1.0。向培养液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100 µg/mL，并在30 °C下继续振荡15分钟。15分钟后，将培养液倒入250 mL离心管中，并用冰填充。

从这一步开始，所有操作均需在冰上进行。在4°C条件下，以8,000 × g离心五分钟。重悬沉淀物于10毫升预冷的冰浴裂解缓冲液中，并转移至15毫升聚丙烯管中。在4°C条件下，以5,900 × g离心三分钟，重悬沉淀。

将沉淀重悬于0.5毫升裂解缓冲液中。将悬液转移至1.5毫升微量离心管中，然后加入0.5毫升预冷的经焙烧酸洗的玻璃珠。涡旋振荡细胞4次，每次30秒，每次振荡后将离心管置于冰上冷却30秒。

然后向1.5毫升离心管中再加入0.5毫升裂解缓冲液，在4°C下以5,000 × g离心5分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，在4°C下以最大速度离心10分钟。

最后，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。提取物可保存于-80°C，用于将裂解液转移至蔗糖梯度。将移液器枪头紧贴离心管管壁靠近梯度表面处，轻柔地将裂解液铺加在梯度上方。

对于35毫升的梯度溶液，通常上样500微升裂解液。使用镊子小心将梯度溶液放入摆动桶转子的吊桶中。在4摄氏度条件下，以100,000 × g离心4小时。

在四小时离心结束前约 30 分钟，将针头连接到管路穿刺器上，并将笔连接到在线吸光度荧光监测仪。打开吸光度监测仪的电源，以便在分析样品前达到稳定的基线。

通过连接 DI 1 48 U 数据采集单元，可实时轻松获取 PolyZone 谱图的电子数据。将注射泵用 50 毫升氟化坚果以反向流动快速设置填充后，连接至图表记录仪。确保其中无气泡存在。

将注射器的管路连接到穿管器上。然后短暂开启 Flo 惰性气体以每分钟 6 毫升的流速正向流动，以排出管路中的任何气泡。为清除气泡，在流动池末端的管路下方依次放置一系列试管，用于收集流出的样品。

准备一个冰桶，并在其中预先制备好用于放置含蔗糖梯度的离心管的孔洞。当四小时的离心完成后，小心地将离心管从离心转子中取出，并立即置于冰上，注意避免扰动梯度。

为分析细胞提取物，将梯度管置于穿刺架上，将管子顶端连接至出口并固定。抬起底部载物台，使针头刺入离心管底部。以每分钟六毫升的流速开始向前流动荧光素标记物。

当液体开始流入试管后，观察在线紫外吸收监测仪上指针的移动情况。当指针开始移动时，将记录仪的走纸速度调至60。当多核糖体图谱末端到达时，关闭流向离心管的Flo惰性气体流动，并停止吸收荧光监测仪上的记录仪走纸。

通过以快速的反向流速将Flo inert从离心管回吸至注射器中，注意不要将蔗糖吸入注射器内。将离心管从穿刺针上拧下，降低针头并取下离心管。此处展示的是在环己酰亚胺存在下从酵母中制备的核糖体提取物的代表性图谱。

图中标示了包含多核糖体以及A位点60S和40S核糖体的紫外吸收峰。我们刚刚向您展示了如何进行多核糖体分析。在执行该实验步骤时，务必注意操作迅速，保持样品低温，并防止RNA降解。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。