利用基于甲基化CpG结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面DNA甲基化分析

本实验的总体目标是通过下一代测序技术研究慢性淋巴细胞白血病患者全基因组甲基化谱，并鉴定差异甲基化的富含CpG区域。该方法有助于解答表观遗传学领域的关键问题，例如识别潜在的慢性淋巴细胞白血病特异性标志基因、疾病发病机制及预后相关基因。该技术的主要优势在于能够以无偏倚且不依赖PCR的方式，实现对全基因组CpG甲基化的全面覆盖。

首先，使用市售的DNA提取试剂盒，按照制造商提供的方案从患者及正常的外周血单个核细胞样本中分离基因组DNA。根据文本方案中所述方法对基因组DNA进行定量后，将每个样本的5微克基因组DNA用TE缓冲液稀释至总体积200微升，得到终浓度为25纳克/微升的溶液。接下来，在特制的试管中使用超声波破碎仪进行超声处理，总共进行30个循环，每个循环包括30秒超声开启和30秒关闭。

每进行五个循环后，短暂离心管子，使样品全部收集至管底。使用文中所述的DNA电泳方法检测所有样品的超声破碎效果。为准备磁性链霉亲和素珠，首先将试剂盒提供的原液管中的珠子重新悬浮。

轻轻吹打磁珠，使其上下混合均匀，形成均一悬浮液。每5微克片段化DNA样本，取50微升磁珠加入到分别标记的洁净1.5毫升离心管中。加入50微升1X磁珠洗涤缓冲液，使终体积达到100微升。

将离心管置于磁力架上静置1分钟，使所有磁珠聚集在靠近磁铁一侧的管壁上。使用200微升移液器小心吸除上清液，避免触碰磁珠。随后将离心管从磁力架上取下，加入250微升1X磁珠洗涤缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀磁珠。

对所有样品至少重复上述步骤四次后，最后将样品重悬于 250 µL 的 1× 珠洗涤缓冲液中。将样品置于冰上保存。为使 MBD-生物素蛋白与洗涤后的磁珠结合，首先将 35 µL 蛋白分别加入不同的离心管中，并用 1× 珠洗涤缓冲液将总体积调至 250 µL。

将250微升稀释的MBD蛋白加入250微升洗涤后的磁珠中，并在室温下进行末端对末端旋转孵育。蛋白与磁珠混合一小时后，将离心管置于磁力架上一分钟，洗涤与蛋白结合的磁性链霉亲和素磁珠。使用移液器移除液体时，避免接触磁珠。

然后，加入 250 微升 1× 磁珠洗涤缓冲液，将离心管置于旋转混合仪上，在室温下孵育 5 分钟。重复洗涤步骤两次，再将洗涤后的 MBD-生物素磁珠重悬于 200 微升 1× 磁珠洗涤缓冲液中，使磁珠准备好用于甲基化 DNA 的捕获。在一支洁净的 1.5 毫升无 DNase 离心管中，加入 100 微升每毫升磁珠洗涤缓冲液和 180 微升片段化的基因组 DNA。

用无DNase水将终体积调至500微升。向剩余的20微升片段化基因组DNA中加入380微升无DNase水。将样品冷冻，以便后续进一步处理，并用作输入DNA对照。

将含有洗涤后的 MBD-生物素磁珠的离心管置于磁力架上静置 1 分钟，移除上清液时注意不要扰动磁珠。随后，加入 500 µL 用磁珠洗涤缓冲液稀释的片段化基因组 DNA。用石蜡膜将所有离心管严密封口，并于 4 °C 下在往返旋转仪上以每分钟 8 至 10 转的速度孵育过夜。

在DNA与MBD磁珠结合反应完成后，将离心管置于磁力架上静置1分钟，使所有磁珠聚集于管壁内侧。用移液器小心吸除上清液，避免接触磁珠，并将此未结合的DNA样品组分保存在冰上。随后向磁珠中加入200微升1×磁珠洗涤缓冲液，将离心管置于旋转仪上，在室温下孵育3分钟。

使用磁力架去除液体后，再重复洗涤两次，以去除残留的未结合DNA。最后一次洗涤后，加入试剂盒中提供的200微升高盐洗脱缓冲液，以洗脱DNA。然后，将离心管置于旋转架上，在室温下孵育15分钟。

孵育结束后，将样品置于磁力架上静置1分钟，然后用移液器小心地将上清液转移至一个新的、洁净的1.5毫升离心管中。接着，向磁珠中加入200 µL高盐洗脱缓冲液，并在室温下旋转孵育15分钟以重复洗脱步骤。将第二次洗脱液加入同一管中，与先前的200 µL第一次洗脱液合并。

为了沉淀DNA，向400微升洗脱的DNA中加入1微升糖原、40微升3摩尔的醋酸钠（pH 5.2）和800微升预冷的无水乙醇。同时将上述试剂加入先前已冷冻的400微升输入DNA对照样品中。充分涡旋混匀各管，然后在-80摄氏度下孵育过夜。

第二天，在 4 摄氏度下以 12,000 × g 离心 30 分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。然后，加入 500 微升 70% 乙醇，并涡旋振荡试管。

在相同条件下再次离心样品管，但离心时间为15分钟，然后用移液器小心吸去上清液。接着，在室温下以最大转速离心1分钟，并用移液器吸头彻底去除残留的乙醇。将沉淀物在室温下空气干燥5分钟。

最后，在进行甲基化DNA定量、MBD测序及分析之前，向DNA沉淀中加入10 µL无DNase的水，具体步骤如文本方案所述。分析结果显示，与正常对照相比，CLL样本中存在多个差异性高甲基化和低甲基化区域。这些差异甲基化区域被定位至不同类别的蛋白质编码基因和非编码基因。

最后，数据分析显示，通过两种不同正常对照比较获得的慢性淋巴细胞白血病（CLL）相关差异甲基化区域之间存在显著重叠。在此，利用焦磷酸测序技术，在大量CLL样本中验证了两个差异甲基化基因靶向区域内的所有CpG位点。本文展示了该方法所需的超声处理最佳范围。

这一片段化DNA的片段范围非常适合用于下一代测序。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两天内完成。在进行该实验时，影响最终DNA回收效果的关键因素包括所用输入DNA的质量和数量，以及超声处理后DNA片段的大小范围。

我们决定采用这种方法，因为这是首个基于免疫沉淀富集全基因组甲基化DNA区域的慢性淋巴细胞白血病（CLL）全基因组甲基化研究。该技术的意义可延伸至预后判断或治疗领域，因为所鉴定出的差异甲基化特征基因可作为全局性正常生物标志物以及表观遗传治疗靶点。在完成该操作流程后，所富集的甲基化DNA还可用于其他下游应用，例如通过杂交或进行微阵列分析，利用芯片上固定的CpG位点集合，便捷地比较两个样本或不同疾病状态之间的甲基化组差异。

最后，这是一种经济高效的检测技术，可用于分析大量患者样本中遍布全基因组的甲基化序列，包括覆盖蛋白质编码基因的已注释序列，以及覆盖重复元件和长链非编码RNA的非注释序列。