数字滴定PCR法用于定量小鼠视网膜中AAV转导效率

在本视频中，我们将展示如何使用数字滴定PCR方法定量小鼠视网膜中的AAV转导效率。该方法极为灵敏，可对目标DNA进行绝对定量。我们开发此方法主要用于较大的AAV载体，这类载体无法容纳报告基因，例如基于CRISPR的构建体。通过使用该方法，我们可以直接定量AAV在视网膜中的转导率。

该方法依赖于数字滴定PCR的高灵敏度和绝对定量能力，可获得直接明确的结果。在本视频中，我们将展示如何利用数字滴定PCR方法定量小鼠视网膜中AAV的转导效率，该方法具有极高的灵敏度，并能对目标DNA进行绝对定量。我们开发该方法主要用于那些无法使用报告基因（如基于CRISPR的构建体）的大片段载体。

通过使用该方法，我们可以简单地量化 AAV 在视网膜中的转导效率。该方法依赖于双液滴 PCR 的高灵敏度和绝对定量能力，可获得直观明确的结果。由于数字液滴 PCR 技术的高效性，已有多个实验室从定量实时 PCR 转向数字液滴 PCR 或 AAV 滴度测定。

该方法还可为视网膜中线粒体DNA的定量提供基础，并可用于检测基于CRISPR的基因治疗在小鼠视网膜中突变校正的效率。用AAV辅助质粒、AAV衣壳质粒、AAV载体和PI溶液在5 mL中制备转染混合物。将5 mL制备好的转染混合物加入培养基中。

将转染后的细胞在37摄氏度下孵育。在转染后48至60小时收集培养基。用DNase以终浓度250单位/毫升在37摄氏度下消化培养基30分钟，然后在4摄氏度下以4,000 ×g离心30分钟。

用 PBS 预润湿再生纤维素膜。使用 0.22 微米注射器滤器将培养基过滤至预润湿的再生纤维素膜中，截留分子量为 100 千道尔顿。在 4,000 ×g、4 °C 条件下离心再生纤维素膜 30 分钟，弃去滤液。

用含有0.001% Pluronic F68的PBS洗涤再生纤维素膜，并在4°C、4000 G条件下离心30分钟，重复三次。从再生纤维素膜的上层收集浓缩的AAV，用于后续实验。此处展示了如何进行小规模AAV的制备。

在验证本方案后，您应能够制备出足以在视网膜中观察到报告基因表达的 AAV。您还可以遵循数字 PCR 方案，以对所制备的 AAV 进行滴度测定。在麻醉前，使用含有 0.5% 托吡卡胺和 2.5% 盐酸去氧肾上腺素的眼药水滴一滴，以散大瞳孔。

使用异氟烷麻醉小鼠并验证反射。注射前在每只眼睛中滴加0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松无菌眼用溶液。使用手术钩固定上眼睑。

轻轻向后牵拉以暴露眼部的背侧。将钩子固定在绷带上以保持其位置。使用弯头虹膜剪除去结膜，暴露眼球的巩膜。

使用新的无菌30G胰岛素注射器穿刺巩膜。通过显微操作仪将微量注射器的针头经同一穿刺点插入。将针头尖端置于眼杯中央晶状体后方。

将一微升 AAV 溶液缓慢注射至眼内玻璃体中。留针一分钟，然后缓慢拔出针头。在眼杯中涂抹含有 0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松的抗炎及抗菌外用凝胶。

在麻醉前滴一滴含0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素的眼药水以散大瞳孔。将每克含2毫克卡波姆的局部凝胶涂抹于眼部表面。

根据需要调整小鼠支架，使小鼠眼睛居中。在玻璃体内注射后一周和两周，对双眼进行眼底及荧光成像，以监测TdTomato表达。在操作前，采用二氧化碳吸入法处死动物。

使用13.5厘米的分离镊将眼球向前移动。移除晶状体及残留的玻璃体。用精密弯镊切断眼球与视神经的连接，并用同一把弯镊轻轻挤压视网膜。

使用商业化蛋白酶K消化膜法组织基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。在55摄氏度、200 G条件下，用蛋白酶K消化视网膜30分钟。彻底裂解视网膜，并按照制造商的说明书进行操作。在这些方案中，我们展示了玻璃体内注射、眼底荧光成像，以及视网膜和基因组DNA的提取。

这些是视网膜研究中的关键步骤，通过遵循本方案，您应能够注射所制备的腺相关病毒（AAV），并追踪其表达情况。同时可通过定量视网膜基因组DNA中的AAV基因组来评估转导效率。在此，您可以看到数字滴定PCR的基本应用，即对转导至视网膜细胞中的AAV基因组进行绝对定量。

将注射后视网膜的基因组DNA用0.05% Pluronic F-68溶液稀释，使每个样本的终浓度达到每微升1纳克。在20微升PCR反应体系中进行液滴生成，反应体系包括1纳克基因组DNA、125纳摩尔引物和2× Evergreen Super Mix。将样本混合液加载至微流控芯片的中部区域，用于生成液滴。

随后将 70 微升的液滴生成油加入芯片的底排。将垫圈置于芯片上方，确保垫圈与芯片之间无间隙。

然后将其放入液滴生成器中。轻轻吸取顶部钟形区域生成的大约40微升液滴，将液滴溶液加入半裙边96孔PCR反应板中。

使用铝箔封膜将PCR板用PCR板封膜仪密封。将PCR板放入96孔热封循环仪中。采用本文所述的ddPCR实验方案。

将PCR板放入液滴读取仪中以分析数据。观看本视频后，您应能够掌握基本的数字PCR技术。您还可以使用含有少量材料的细胞，这非常适合数字PCR技术。

然而，您应仔细调整目标 DNA 的量，以确保不超过数字滴定 PCR 的检测上限。以下是实验流程图。我们进行了小规模 AAV 制备，随后进行 AAV 滴度测定。

然后进行玻璃体内注射。之后，通过眼底荧光成像定量分析荧光强度。随后分离小鼠视网膜，并从视网膜组织中提取基因组DNA用于微滴数字PCR（ddPCR）。

滴定 AAV 对于准确量化 AAV 转导也至关重要。ddPCR 依赖于生成含有稀释后目标 AAV 基因组的液滴。代表性 ddPCR 结果显示了针对 AAV 基因组的阳性与阴性液滴。

高于阈值为阳性，低于阈值为阴性。乘以稀释倍数后，发现腺相关病毒（AAV）的滴度为每毫升10的12次方基因组拷贝。为了准确量化AAV的转导效率，注射了多个视网膜。

对注射后的动物进行成像，并计算荧光平均强度。在两周时间点，分离视网膜组织，并使用WPRE和18S引物进行数字滴定PCR（ddPCR）检测。

AAV 注射视网膜的荧光强度与 AAV 基因组定量结果呈正相关，显示出该方法的优越性。在此，我们展示了多种技术，包括小规模 AAV 制备及玻璃体内注射。