通过数字滴定聚合酶链式反应定量纯化载体样品中的腺相关病毒基因组

dd_PCR 是一种广泛用于测定 AAV 基因组滴度的技术，但目前尚无统一的标准操作流程。本方案提供了一套经过验证的、逐步指导如何制备样品并执行 dd_PCR 以实现准确基因组滴定的操作指南。与 qPCR 相比，dd_PCR 具有多项优势，包括更高的精确度、更强的稳健性，以及无需标准曲线即可对目标序列进行更绝对和直接的定量。

此外，通过精心设计的引物探针组合，数字液滴PCR（dd_PCR）能够实现特异性检测，而不同于其他检测全部DNA的技术。建立用于载体基因组定量的标准化共识方案，将提高不同实验室间重组腺相关病毒（AAV）质量控制的可靠性和一致性，从而促进更广泛的研究和临床领域对重组AAV载体的应用。

首先，涡旋混匀腺相关病毒（AAV）样品并离心，以确保所有液体均位于管底。向一个0.2 mL的PCR 8联管中加入45 µL含DNase I的溶液。将5 µL的AAV样品转移至含有DNA溶液的管中。

涡旋振荡后，短暂离心样品以确保所有液体位于管底。使用PCR仪，在37摄氏度下孵育样品1小时，然后将其冷却至4摄氏度。接下来，在新的0.2毫升PCR 8联管中，用AAV稀释缓冲液对经处理的DNA样品进行适当稀释。

经过连续稀释后，涡旋混匀样品并离心，以确保所有液体均位于管底。按所需体积将正向引物、反向引物、探针、dd_PCR 超混合液和无 DNase 水混合。涡旋混匀主混合液，并短暂离心试管。

然后将19.8 µL主混合液转移至新的0.2 mL PCR 8联管中的每根离心管中。首先，准备经DNase I处理的AAV样品和dd_PCR主混合液。在PCR 8联管的每根离心管中加入2.2 µL稀释后的样品至19.8 µL dd_PCR主混合液中，并充分混匀。

将20微升混合物转移至液滴生成芯片中间样品排的各孔中。然后将60微升液滴生成油转移至液滴生成芯片下部油排的各孔中。将橡胶垫圈盖在液滴生成芯片上，随后将其放入液滴生成仪中。

生成液滴后，使用八通道移液器将42.5微升溶液从液滴生成卡盒中缓慢转移至96孔PCR板中。使用热封仪在180摄氏度下加热5秒，用铝箔封膜密封PCR板。进行扩增时，将PCR板放入配备96深孔反应模块的热循环仪中，确保盖子闭合，然后运行PCR程序。

完成后，将反应板放入液滴读数仪中，在系统软件中输入所需信息并开始读数。在第一维振幅图中观察到阳性和阴性液滴之间有清晰的分离，表明测量成功。第二个第一维振幅图显示了液滴雨现象，液滴散布在阳性和阴性群集之间，提示可能存在测量准确性问题。

一次AAV实验的输出数据表明，当同一样品在两种不同稀释度下进行重复测定时，结果具有一致性。