真核生物糖原代谢研究的分光光度法

这些实验方案具有重要意义，因为它们避免了放射性同位素的使用，消除了可能阻碍许多研究人员研究糖原代谢酶的障碍。所描述的实验步骤成本低廉，仅需使用普通的分光光度计即可完成。首先测定糖原合酶活性时，将先前配制的UDP-葡萄糖、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸和NDP激酶的储备溶液置于冰上解冻。

将水浴预热至30摄氏度。当储备液准备好后，根据糖原合酶检测的数量，按照文本方案中的描述，将试剂加入15毫升试管中，制备足够量的检测混合液。通过用水替代反应混合物中的NADH来制备空白反应，并将反应液转移至一次性丙烯酸甲酯比色皿中。

使用空白反应在340纳米波长下将分光光度计调零。取770微升反应混合物至1.5毫升离心管中，依次向管中各加入2微升NDP激酶和丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶混合液。混匀后，将离心管轻轻放入30摄氏度水浴中孵育3分钟，以预热反应混合物。

然后加入含有糖原合酶的样品30 µL，样品溶于pH 7.8的20 mmol/L Tris缓冲液中，轻轻混匀，再将反应混合物转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。将比色皿放入分光光度计，于340 nm波长处以定时间隔记录吸光度，持续10至20分钟。随后，以时间为横坐标，绘制吸光度随时间变化的曲线。

为测定释放的葡萄糖，将加热后糖原样品的40微升上清液转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。然后按照文稿中的描述，加入三乙醇胺、盐酸硫酸镁缓冲液、NADP ATP混合液以及水的测定体积。通过轻轻吹吸混合液，注意避免产生气泡。

向每个比色杯中加入 0.5 µL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。用移液器混匀后，在室温下孵育 10 分钟，然后在 340 纳米处测定吸光度。接着，按照前述方法向每个比色杯中加入 0.5 µL 己糖激酶，混匀后孵育 15 分钟，再在 340 纳米处记录吸光度。

然后在室温下继续孵育5分钟，随后测定吸光度。如果吸光度较15分钟时记录的数值有所增加，则继续孵育5分钟，再记录340纳米处的最终吸光度。为测定糖原分支度，取650微升碘-氯化钙显色试剂储备液与100微升水加入1.5毫升离心管中，充分混匀后转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。

将比色皿放入分光光度计中，在330至800纳米波长范围内进行扫描，以采集背景光谱。在另一个1.5毫升离心管中，加入650微升工作浓度的碘-氯化钙显色试剂和50微克牡蛎糖原，再加水定容至终体积750微升。充分混匀后，将溶液转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中，采集330至800纳米范围内的吸收光谱。

同样，按照之前所述方法，分别取50微克支链淀粉和30微克直链淀粉，获得其吸收光谱。为初步判断一种未表征糖原样品的支化结构，可将25至50微克糖原与650微升工作浓度的碘-氯化钙显色试剂混合，然后按照前述方法操作，获取吸收光谱。在糖原合酶活性检测中，观察到340纳米处的吸光度随时间呈线性下降。

向测定中加入过多的糖原合酶会导致反应在前两分钟内即完成。不含糖原合酶的对照反应未显示出可测的吸光度下降。使用纯化酶进行的糖原磷酸化酶测定数据显示，其线性阶段持续三分钟。

吸光度每分钟增加0.01至0.04个单位为最佳范围。在糖原去分支酶活性检测中，反应呈现至少持续10分钟的线性阶段。糖原分支酶活性检测的代表性数据展示了不含分支酶的对照样品与含有分支酶的反应体系之间吸光度的差异。

该检测方法的动态范围较窄，如图所示。吸光度最大变化仅为0.4个吸光度单位，当吸光度变化达到约0.2个吸光度单位时，线性关系即已丧失。在糖原分支活性评估中，所用糖原、支链淀粉和直链淀粉的质量均表现出最大吸光度读数，约为0.7至0.8，各自在不同的吸光度峰值处达到最大值。

糖原样品在约400纳米和460纳米处产生两个峰。碘-氯化钙显色试剂密度较高，因此在采集吸收光谱前，必须确保糖原样品与试剂充分混匀。