从真核细胞中对蛋白质复合物进行串联亲和纯化

该串联亲和纯化方法的总体目标是从真核细胞中分离表达的蛋白质复合物，用于生化表征、分子组装，并鉴定调控其功能的新型相互作用蛋白和翻译后修饰。该方法能够从真核细胞中纯化出完整的蛋白质复合物，以鉴定新的相互作用蛋白以及精细调控其功能的调控性翻译后修饰。该技术的主要优势在于，可获得高纯度和高得率的蛋白质复合物，适用于后续体外实验，以研究其功能与活性。

转染后48小时，从STREP亲和纯化中收集细胞。移除培养基，加入八毫升冷的PBS。用移液器吹打数次，使细胞从培养板上脱落。

收集细胞悬液并转移至15毫升离心管中，在4°C条件下以800 × g离心4分钟。弃去PBS上清液。在4°C条件下以800 × g再次离心1分钟，以彻底去除残留的PBS。

开始此实验步骤时，用相当于细胞沉淀体积五倍的被动裂解缓冲液（PLB）重悬每个细胞沉淀。将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。短暂涡旋振荡悬液，并在4°C下旋转孵育30分钟。

在4 °C条件下，以10,000 × g离心10分钟，使细胞悬液沉淀。将上清裂解液转移至新的1.5 mL微量离心管中，并弃去细胞沉淀。保留上清裂解液终体积的10%作为STREP-AP输入样品，并于4 °C保存。

第一步亲和纯化必须使用STREP磁珠，因为使用STREP磁珠捕获的复合物所回收的蛋白量显著高于使用FLAG磁珠捕获的复合物。使用宽口移液器吸头吸取适量的50% STREP磁珠悬液用于亲和纯化。在4°C条件下，以1,500 × g离心2分钟。

去除上清液，向珠子中加入 500 µL PLB。在 4 °C 下轻轻摇动珠子混合物 5 分钟。再次离心沉淀。

第三次洗涤后，弃去上清液，并将磁珠重悬于PLB中，终体积为n乘以40微升，其中n为样本数量。向每份细胞裂解液样本中加入40微升50% STREP磁珠悬液，在4摄氏度下旋转孵育两小时。在蛋白质表达与回收过程中可使用多块细胞培养板，来自不同培养板的相同蛋白质样本裂解液可在STREP亲和纯化步骤中合并，并与一份磁珠混合。

细胞裂解液与STREP磁珠悬液混合物在孵育两小时后，在4°C条件下以1,500 × g离心两分钟。保留上清液作为STREP亲和纯化流穿液，并于4°C保存。向磁珠中加入500 µL STREP亲和纯化洗涤缓冲液一。

将珠子在缓冲液混合物中于 4 摄氏度下轻轻摇动孵育 5 分钟，然后在 4 摄氏度下以 1,500 × g 离心 2 分钟。弃去上清液，并用 500 µL STREP AP 洗涤缓冲液一洗涤一次。第三次洗涤后，将珠悬液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，以降低蛋白背景。

用STREP AP洗涤缓冲液一进行第四次洗涤。离心后，弃去上清液，加入500 µL洗涤缓冲液二。通过倒置试管使磁珠平衡，然后在4 °C下以1,500 × g离心2分钟。

弃去上清液。用50微升STREP洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。在4摄氏度下，以800转/分钟涡旋振荡15分钟。

在4 °C条件下，以1,500 × g离心1分钟，使磁珠沉淀。收集上清液。此组分对应于STREP亲和纯化洗脱样品。

将珠子组分保存在4°C，用于第二次洗脱。取10%的STREP亲和纯化洗脱液用于银染和/或Western印迹分析。为了增加后续FLAG免疫沉淀的起始材料量，可将第一次和第二次STREP洗脱液合并，以更高效地回收FLAG洗脱产物。

使用宽口移液器吸头将适量的 FLAG 磁珠溶液转移至微量离心管中，开始此操作。在 4°C 条件下，以 1,500 × g 离心 2 分钟。弃去上清液，并向磁珠中加入 500 µL FLAG 洗涤缓冲液。

在4°C条件下，以1,500 × g离心2分钟。弃去上清液，并用FLAG洗涤缓冲液再次洗涤。第三次洗涤后，移除上清液，将磁珠重悬于FLAG洗涤缓冲液中，最终体积为n × 16 µL，其中n为样本数量。

向剩余的STREP亲和纯化洗脱液中加入16微升FLAG磁珠悬液，并在4摄氏度下轻轻旋转孵育过夜。在FLAG磁珠悬液与STREP亲和纯化洗脱液过夜孵育后，进行FLAG免疫沉淀实验。在4摄氏度下以1,500 × g离心2分钟，使FLAG磁珠悬液沉淀。

将上清液保存为 FLAG 免疫沉淀的穿流液，并在 4 °C 下保存。向珠子中加入 500 µL FLAG 洗涤缓冲液。在 4 °C 下轻轻摇动孵育 5 分钟，然后在 4 °C 下以 1,500 ×g 离心 2 分钟。

弃去上清液，并用500微升FLAG洗涤缓冲液再次洗涤。第三次洗涤后，将蛋白珠溶液转移至新的1.5毫升微量离心管中以减少背景干扰。再用FLAG洗涤缓冲液洗涤第四次。

从最后一次离心的上清液中去除上清，向珠子中加入30微升含有200纳克/微升FLAG肽的FLAG洗涤缓冲液。在4摄氏度下以800转/分钟涡旋振荡两小时。两小时后，在4摄氏度下以1,500 × g离心两分钟，使悬浮物沉淀。

收集上清液，并在4 °C下保存，作为FLAG免疫沉淀洗脱液。在本视频中，串联亲和纯化（Tandem affinity purification，简称TAP）方法被应用于Cyclin-T1-CDK9复合物。在HEK293 T细胞中过表达STREP标记的Cyclin-T1和FLAG标记的CDK9。

还进行了反向实验，使用STREP标记的CDK9和FLAG标记的Cyclin-T1。Western印迹分析显示，FLAG标记的CDK9与STREP标记的Cyclin-T1一同从STREP磁珠中洗脱出来，但在阴性对照（缺乏STREP标记的Cyclin-T1的AP）中未检测到。两种蛋白均在FLAG洗脱组分中被检测到，进一步证实了复合物的形成。

反向TAP结果表明，带FLAG标签的Cyclin-T1与带STREP标签的CDK9共洗脱，进一步验证了Cyclin-T1与CDK9的相互作用与所用表位标签无关。TAP及反向TAP的结果也通过银染进行分析。星号表示共洗脱的杂质。

FLAG 标签的 CDK9 与 STREP 标签的 Cyclin-T1 一同从 STREP 磁珠中洗脱下来，但在对照亲和纯化实验中未发生共洗脱。在随后的 FLAG 洗脱步骤中，STREP 标签的 Cyclin-T1 与 FLAG 标签的 CDK9 一同从 FLAG 磁珠中洗脱下来。类似地，FLAG 标签的 Cyclin-T1 与 STREP 标签的 CDK9 一同从 STREP 磁珠中洗脱，但在对照亲和纯化实验中未观察到该现象。蛋白质-蛋白质复合物在第二次 FLAG 免疫沉淀步骤后被高效回收。只要操作得当，在细胞准备收集后，掌握该技术的研究人员可在两天内完成整个实验。

在进行该实验操作时，重要的是要相应增加每个实验的细胞培养板数量，以确保能够回收并检测到足够的蛋白。例如，用于鉴定新的调控亚基和/或研究复合物亚基上的翻译后修饰。该技术建立后，为研究真核细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的研究人员探索新的相互作用蛋白及翻译后修饰提供了重要途径。

观看本视频后，您应充分了解如何使用STREP和FLAG标签来分离和表征蛋白质。