利用透射电子显微镜定量分析骨骼肌纤维中糖原的亚细胞分布

测量单个细胞及亚细胞结构中的糖原含量非常重要，因为在大多数细胞类型中，单个细胞对生理条件变化和疾病的适应方式各不相同。因此，该技术的主要优势在于透射电子显微镜下具有极高的分辨率。这提高了对亚细胞结构进行精确定位的可能性。此外，在本技术中，糖原染色无需使用抗体，这一点至关重要。

因此，我们无需担心特异性问题。为了获得更好的糖原对比度，只需使用1.5%的亚铁氰化钾代替铁氰化钾即可。在2毫升微量离心管中，将2.5%戊二醛溶于0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液中，配制1.6毫升初级固定液。

将其保存在5°C下，最多可保存14天。从肌肉活检组织或整块肌肉中分离出一个最大直径在任何方向上不超过1毫米、且纵向长于横截面的小样本。将该样本放入含有冷的初固定液的试管中。

将样本在 5 °C 下保存 24 小时。然后用 0.1 mol/L 的二甲胂酸钠缓冲液洗涤样本四次。使用移液管从离心管中移除废液，注意不要触碰样本，随后加入新鲜缓冲液。

将样本在四摄氏度下，用含1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾的0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液后固定120分钟。在室温下用双蒸水冲洗样本两次。在室温下将样本浸入梯度浓度的乙醇中进行脱水。

在室温下，使用上述体积比的丙烯氧化物与环氧树脂梯度混合液对样本进行浸透。次日，将样本包埋于模具中的100%新鲜环氧树脂中，并在60摄氏度下聚合48小时。将样本块固定于超薄切片机的持样器上。

用剃刀在表面修整包埋块，直至暴露组织层面。将金刚石刀安装在样品前方，并调整样品表面与刀刃平行。使用金刚石刀切出厚度为一微米的半薄切片，以检查样品的取向。

用甲苯胺蓝对半薄切片进行染色，以便在光学显微镜下观察。随后进一步修整包埋块，缩小目标区域，以获得合适的超薄切片。使用第二把金刚石刀切割厚度为60至70纳米的超薄切片。

使用完美环在一张完整的铜网上收集一到两段切片。为对切片进行染色，将铜网浸入醋酸铀酰溶液中20分钟，用双蒸水清洗铜网，然后将铜网浸入柠檬酸铅溶液中15分钟，再用双蒸水重新清洗铜网。打开透射电子显微镜计算机及图像采集软件，使用数字慢扫描CCD相机及配套成像软件记录数字图像。

将含有多个区域的载网放入显微镜载物台后，首先在低倍镜下观察载网，选择质量最佳的切片区域，并确定肌纤维的走向。随后，在放大倍数超过30,000时聚焦图像，使电子束中心对准切片中的周边肌纤维，并在目标放大倍数下以1秒曝光时间采集图像。确保图像在肌纤维的长度和宽度方向上以随机而非系统性的方式分布，以获得无偏倚的结果，并重复成像过程，直至完成6至10根肌纤维的成像。

通过点击“文件”后选择“打开”，将图像导入 ImageJ。通过点击“分析”然后选择“设置比例尺”，将全局比例尺设置为与图像原始尺寸一致。要将图像放大至100%，请点击“图像”，进入“缩放”菜单后点击“放大”。

使用工具菜单中的直线工具，测量每张图像中肌原纤维区域的一个Z盘厚度，并计算每条六到十条纤维的平均Z盘厚度。使用分段线工具测量紧邻肌膜下区域下方可见的最外侧肌原纤维的长度。如需插入网格，请点击分析，选择工具，然后选择网格。

现在将每个点的面积设置为 32,400 平方纳米。在 12 张肌膜下区域图像中，统计交叉点与肌膜下糖原相交的次数。通过点击分析，然后选择工具，接着选择网格，并将每个点的面积设置为 160,000 平方纳米，插入网格。

统计第12张肌原纤维图像中横线穿过肌内肌原纤维间隙的交点数量。然后再次插入网格，点击分析，选择工具，再选择网格。将每个点的面积设置为3 600平方纳米。

统计第12张肌原纤维图像中十字交叉点与肌原纤维内糖原相交的次数。通过点击分析（analyze），然后选择工具（tools），接着选择网格（grid），并将每个点的面积设置为32,400平方纳米来插入网格。统计第12张肌原游戏副本中十字交叉点与肌原纤维间糖原相交的次数。

使用 32,400 平方纳米的网格随机选择糖原颗粒，从左上角方格开始，必要时向左移动。使用直线工具，对每张图像中每个池的五个随机选择的糖原颗粒测量其直径，从而获得每池每根肌纤维平均 60 个颗粒的数据。该图显示了三个糖原池的正常值。

可以观察到，肌原纤维间糖原的数值分布接近正态分布，而肌原纤维内和肌膜下糖原则呈现偏态分布，某些肌纤维中糖原含量有时异常增多。在所有步骤中，使用亚铁氰化钾非常关键。糖原分析可与线粒体和脂滴分析相结合，这有助于加深我们对其他关键代谢组分与糖原及肌肉健康之间关联的理解。