利用顺磁弛豫增强技术检测和表征内在无序蛋白的自关联行为

顺磁弛豫增强技术可用于表征和测量分子间距离，并量化瞬时和/或低丰度的生物分子相互作用。本文中，我们应用该技术捕获了蛋白质凝聚前发生的相互作用。由于PRE具有高灵敏度，能够以原子分辨率识别、检测和量化那些对其他核磁共振技术不可见且难以捕捉的动态状态。

本方案中的关键步骤包括去除未结合的硝酰自由基自旋标签，并仔细分析谱图以准确测量峰高。此外，在核磁共振实验设置和脉冲校准过程中必须格外小心。首先，从储备液中加入3-马来酰亚胺基-PROXYL，使其摩尔浓度为15N同位素标记目标蛋白的20倍过量。

在室温或4°C避光、隔绝氧气并轻轻摇动或旋转的条件下孵育过夜。次日，通过蛋白样品的充分透析或凝胶过滤去除未反应的游离自旋标记物，以防止非特异性溶剂PRE效应。随后使用Ellman试剂定量溶液中的游离巯基。

使用微孔板读数仪测量吸光度，并绘制标准曲线。为测量分子内PRE，需制备浓度至少为100微摩尔、但不超过300微摩尔的15N同位素富集的顺磁性自旋标记蛋白，溶于适合核磁共振（NMR）检测的缓冲液中。然后使用长柄玻璃移液管或微量移液器，将NMR样品转移至适用于高场磁体的5毫米NMR样品管中。

将样品放入磁体中。使用锁场命令锁定氘信号，并根据仪器操作规程调节和匹配质子通道。然后使用顶层匀场子程序调节匀场线圈，以优化溶剂信号的抑制效果。

接下来，使用 P-OPT 程序校准质子脉冲。然后针对标准样品校准 15N 脉冲。使用形状工具子程序确定整形脉冲的合适衰减参数。

然后单击文件夹图标打开相应的脉冲形状文件。成形脉冲位于采集参数的脉冲参数部分。加载脉冲定义文件后，单击“分析波形”，然后单击“积分形状”。

输入已校准的质子90度硬脉冲、所需的脉冲形状长度和旋转角度。然后通过将功率水平的变化量加到已校准的90度脉冲的衰减上，计算成形脉冲的功率水平。记录标准的质子15N HSQC谱，以优化扫描宽度、载波频率并检查水峰抑制效果。

最后，使用 SW 和 TD 命令或直接在相应的对话框中调整扫描宽度和间接维增量次数。按照之前演示的方法校准成型脉冲，然后在采集参数选项卡的脉冲参数部分输入校准后的脉冲长度。

采用双时间延迟点法测量酰胺质子T2时，通过编辑VD列表文件来设置时间延迟。第一个延迟设置为0.01毫秒。根据预期的最大PRE关系，选择第二个延迟时间。

然后通过比较第一和第二延迟谱图的初始增量来确定一个合适的值，并调整第二延迟，使信号衰减至其初始值的40%到50%之间。确定需记录的复数点数以及为实现足够信号平均所需的扫描次数。接着使用EXPT命令计算实验时间，并用ZG命令开始实验。将抗坏血酸钠溶解于NMR缓冲液后，调节pH值使其与原始NMR缓冲液的pH一致。

然后，将抗坏血酸以比自旋标记物浓度高10倍的摩尔过量加入核磁共振管中，滴加一滴至管口下方。盖紧管盖，轻轻倒置混匀。使用手动离心机以200至400 ×g离心10至20秒，使样品沉降至管底。

用铝箔包裹反应管后，让反应至少进行三小时。随后使用与顺磁性样品相同的参数，记录抗磁性样品中的酰胺质子T2值。分子内酰胺质子伽马值的PRE数据记录于一段源自RNA结合蛋白EWSR1低复杂度结构域的自缔合内在无序片段上。

在自旋标记连接位点附近序列位置上的残基预期会显著展宽，因此在谱图中无法检测到。那些序列上与连接位点相距较远但显示出增强的γ峰的残基，在空间上靠近自旋标记。对于内在无序蛋白，记录和分析其谱图可提供有关分子内相互作用以及瞬时相互作用表面的信息。

将PRE测量与其他生物物理方法（如动态光散射、尺寸排阻色谱、分析型超速离心以及计算方法）相结合，可提供更深入的见解。PRE测量有助于表征瞬态且低布居的构象态。该方法可进一步拓展用于研究多种重要生物过程中的相互作用，例如分子识别、别构构象选择以及通过相分离组装无膜细胞器等组装过程。