解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手

我们的研究深入探讨了多种聚糖-凝集素系统，探索其与健康和疾病之间的关联。我们融合了化学、生物学和生物医学的方法，深入研究了这些系统在免疫反应中的作用，涉及从癌症到细菌和病毒感染等多种病理过程。近年来，糖科学领域取得了突破性进展，推动了聚糖设计合成的发展，并在从原子水平到细胞水平的结构分子识别方面实现了分析技术的革新。

这些进展共同为先进糖类靶向疗法的蓬勃发展奠定了基础。本实验方案概述了获取、处理和分析糖类研究领域中两种最强大核磁共振（NMR）技术的操作流程。这两种方法——饱和转移差谱法（saturation transfer difference）和化学微扰分析法（chemical shift perturbation analysis），能够互补地提供有关糖类分子识别过程中结构特征与动态行为的精确信息。

首先制备含有蛋白质-配体复合物的样品。然后使用移液器将0.6毫升制备好的溶液小心转移至5毫升核磁共振（NMR）样品管中。为将NMR仪器调节至所需温度，使用edte命令打开温度控制监视器，并设定目标温度。

然后将样品放入样品更换器中。使用自动进样器将样品插入磁体，并运行命令 sx，后接样品在自动进样器托盘中的位置编号。此后，样品即进入核磁共振磁体中。

为锁定溶剂信号，请输入 lock 命令并从菜单中选择合适的溶剂。使用自动模块 ATMA 或手动模块 ATMM 完成调谐和匹配过程。现在使用 topshim 命令，启动自动匀场。

然后执行 pulsecal 命令以确定质子 90 度脉冲。接着，创建一个新的数据集并上传 STD NMR 脉冲序列。在 ACQUPARS 窗口的 FQ 列表项下，定义 STD NMR 实验的关共振和开共振频率。

在无配体或蛋白质质子信号的区域设定偏共振频率，随后在无糖类信号的谱图区域选择共振频率。在 ASED 窗口的 ACQUPARS 参数中定义饱和时间内所使用的 shaped pulse。

随后，设定质子90度脉冲长度，调整总饱和时间为三秒，并将弛豫延迟设为三秒。扫描次数设为8的倍数，虚扫描次数设为8。然后将F2的采样点数设为16K、32K或64K，F1设为2。

现在使用自动命令 rga 设置接收增益，以避免溢出。使用实验命令计算总实验时间。最后，使用 zg 命令启动实验采集。

实验结束后，对第一个自由感应衰减信号（fid）进行傅里叶变换，并选择处理后谱图的保存位置。然后使用 lb 命令调整线宽展宽因子。要手动调整谱图的相位，请进入处理选项卡，然后选择调整相位子菜单。

单击并拖动相应的按钮，执行零阶和一阶相位校正，并保存相位校正结果。对第二次实验进行傅里叶变换后，使用不同的编号保存处理后的谱图。使用多重功能载入两个已处理的谱图，并在多重可视化界面中利用减法按钮对它们进行相减。

然后打开偏共振谱，执行 md 命令以启动多图显示窗口。随后载入 STD 谱。接下来，对 STD NMR 谱中信号的频率和强度进行比较分析。

在离共振实验中，测量信号强度。通过菜单选择处理，然后选择积分。仔细定义感兴趣区域，并将积分值记录到文件中。

同样，测量STD NMR实验中的信号强度，确保使用相同的参数，并将这些积分值记录在单独的文件中。或者，可通过比较STD谱与远离共振谱之间的信号强度来确定STD值。为计算以百分比表示的相对STD值，将具有最大STD强度的质子指定为100%。

人半乳糖凝集素-7与N-乙酰乳糖胺相互作用的质子STD NMR谱显示了表明结合的STD NMR信号。此外，属于质子且与蛋白质近距离接触的信号出现，从而可以界定结合表位。首先使用感兴趣的凝集素制备样品。

配制缓冲溶液时，使用由90%水和10%重水组成的混合液。在获取质子核磁共振谱后，新建一个数据集并选择脉冲程序HSQCETFPF3GP，然后设定所需的实验参数。发送实验进行数据采集，并使用命令xfb处理自由感应衰减信号（fid）。

接下来，对不同比例的15N-半乳糖凝集素-7与N-乙酰乳糖胺结合的样品进行相同的实验，并比较其谱图。然后使用辅助软件，生成所有观测到的交叉峰对应的质子和氮15频率的综合列表。之后，计算最大化学位移扰动值。

构建一个二维图，将最大的化学位移扰动值绘制在垂直的 y 轴上，对应氨基酸残基绘制在水平的 x 轴上。如果蛋白质的三维结构可获得，使用适当的软件打开相应的 PDB 文件。用一种明显的颜色突出显示化学位移扰动最大的残基，以确定可能的结合位点。

将N-乙酰乳糖胺滴定至人源半乳糖凝集素-7溶液中所记录的氢-氮15 HSQC谱图叠加显示，多个交叉峰出现化学位移变化，表明两者之间存在相互作用。受扰动最显著的人源半乳糖凝集素-7氨基酸残基被映射到五聚半乳糖PDB结构中。着色区域可能代表结合位点。