基于草甘膦产品对微生物组潜在影响的量化分析

本文提供了一个工作流程，其中包含用于开展实验以评估草甘膦对微生物组影响的最佳生物信息学方法。该方法的主要优势在于能够为未来的田间和实验室实验提供一个可靠的可检验假设。所描述的方法可应用于多种系统，包括植物、动物和微生物。

方法的每个部分都相当简单直接。也许最具挑战性的部分是组建一个能够完成不同工作的多学科团队。演示该实验操作的将是来自我实验室的研究人员Suni Matthew。

首先，将实验田划分为10个重复的对照组和GBP处理组，各试验小区之间设置植被缓冲带，以开展实验一。对照组小区使用自来水处理，GBP处理组小区则施用市售GBP，以模拟农业生产中允许的最大草甘膦剂量。采集实验植物的微生物群样本。

从田间采集10份植物样品，立即置于冰上，并迅速带回实验室进行后续处理。在实验二中，采集鹌鹑笼舍内的垫料，包括木屑、粪便以及饲喂含草甘膦污染饲料或对照饲料的鹌鹑所产生的撒落饲料，该采集来自为期12个月的 aviary 实验。垫料样品在铺开后应直接送至有资质的实验室进行草甘膦浓度测定。

在每个地块中种植多年生草本植物和草莓植株，以研究其根部和叶片的微生物群。通过清洗和灭菌植物样品，鉴定并去除内生微生物。样品灭菌后，按照生产商的说明书，使用 commercially available 植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

采用巢式扩增方法，扩增16S rRNA基因的可变区V6至V8，并根据文本稿件中的描述为所需数量的样本配制PCR主混合液。第一轮PCR使用799F正向引物和1492R反向引物。在热循环仪中设置35个循环的扩增程序。

为验证扩增效果，取5 µL扩增产物进行电泳分析，然后将剩余的25 µL PCR产物按1:10的比例加入灭菌超纯水中稀释。使用通用引物1062F（正向）和1390R（反向），进行第二轮扩增，循环25次。将所得PCR产物等比例稀释于灭菌超纯水中。

进行第三轮扩增，共八个循环，以在产物上添加条形码和P1接头序列。使用生物分析仪检测PCR产物的质量和浓度，并在1.5毫升离心管中混合各样本等量DNA，每样本取30纳克，以构建等摩尔文库。利用自动化DNA片段大小选择系统，在琼脂糖凝胶盒中通过片段大小分选，选择350至550个碱基对大小的扩增子。

将含有指定大小扩增子的洗脱液收集到卡盒的样品管中，从而获得纯化的16S rRNA基因文库。将收集的洗脱液转移至1.5毫升离心管中，并使用生物分析仪检测其纯度和浓度。使用经高压灭菌的超纯水将DNA文库稀释至终浓度为26皮摩尔。

为了扩增ITS区域，在使用ITS引物建立反应后，设置PCR仪的扩增程序。然后取5微升扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行分析，并用经高压灭菌的超纯水将剩余的25微升产物按1:10的比例稀释。使用带条形码标记的正向引物和带P1接头标记的反向引物，为所需数量的样本配制PCR主混合液。

以稀释后的PCR产物作为模板，进行第二轮扩增。与16S rRNA基因文库构建类似，对纯化的ITS区域进行文库制备。启动EPSPS蛋白序列的生物信息学分析。

根据服务器提供的输出结果评估查询序列对草甘膦的潜在敏感性，其中输出一显示查询序列中存在的氨基酸标记物的比例及基序数量；输出二显示基于标记残基的查询序列与参考序列的比对结果；输出三显示查询序列与参考序列的完整双序列比对结果。

输出四展示了霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）、囊状短波单胞菌（Brevundimonas vesicularis）和达瓦韦氏链霉菌（Streptomyces davawensis）的EPSPS参考序列。在输出页面末尾，可找到指向BLASTp和保守结构域等外部工具的链接，以进一步分析查询的EPSPS序列。在从公共数据库中鉴定出EPSPS序列后，可从EPSPS分类服务器的主页面访问这些数据集，该页面包含超过50,000条序列的分类学信息及EPSPS分类信息。

在田间试验季结束时，称量植物的地上生物量，以比较GBP处理区与对照区植物的生长情况。在电子表格中，将微生物组实验的细菌OTU映射到预先计算的数据集。基于概率评分，计算对草甘膦的内在敏感性。

该方法用于在微进化水平上量化EPSPS蛋白敏感性的变化。在分析的32个亲缘关系较近的原核生物类群中，我们发现了其中12个类群的敏感性状态发生了改变。因此，基于草甘膦的产品的持续使用可能导致植物、动物及土壤微生物组中的微生物失调。

确保在获得最佳扩增子文库时，PCR 前后步骤的质量。在使用软件前，还需确认 EPSPS 蛋白序列完整无缺。在田间试验中，务必防止百草枯污染对照样本。