秀丽隐杆线虫肠道微生物组定量与分析的流式蠕虫检测技术应用

肠道微生物组在塑造宿主生理状态方面发挥着重要作用。该方案特别适用于大规模地对单个细胞级动物中荧光标记的肠道微生物定植水平进行高通量评估。该方法的一个主要优势在于能够实时监测活体动物的肠道微生物组，从而识别出任何变化，并将其与宿主的生理状态进行关联分析。

本实验操作将由我实验室的研究助理 Dana Blackburn 演示。首先用一到两毫升 M9-TX 缓冲液冲洗线虫，将其从细菌菌苔上洗下。然后将线虫转移至已灭菌的 2 毫升 96 孔深孔板中。

在300 ×g条件下离心1分钟以沉淀细胞，并使用抽吸装置去除上清液。使用1.2毫升多通道移液器，向深孔板的每个孔中加入1.8毫升M9-TX，通过反复吹打数次混匀，然后在300 ×g条件下离心1分钟。最后一次洗涤后，使用抽吸装置将每孔体积调整至100微升。

向每个孔中加入 100 微升 10 毫摩尔的左旋咪唑和 M9-T，使线虫麻痹 5 分钟。然后向每个孔中加入 4% 次氯酸钠溶液处理 2 分钟，以减少细菌团块。次氯酸钠处理后，向板的每个孔中加入 M9-TX 洗涤线虫。

第二次洗涤后，离心微孔板并吸除上清液，使最终体积为100微升。将线虫转移至平底96孔板中，每孔加入150微升含10毫摩尔左旋咪唑的M9-TX溶液。每孔线虫密度保持在50至100条之间，若种群过于密集，需将线虫分至多个孔中。

打开空气压缩机、计算机和LPS仪器。检查并清空废液罐。如果鞘液和水箱的液量较低，请检查并补充。

确保 250 微米流体与光学核心组件已安装到位。连接并开启自动进样器。打开自动进样器仪器软件，以开启自动进样器及 LPS 软件。

在 LPS 软件窗口中，进入文件菜单并点击新建实验，然后再次选择文件并点击新建样本检测。如果尚未开启，需启用激光器以打开 488 和 561 纳米激光。现在，在 LPS 软件窗口中使用飞行时间、消光和荧光通道创建采集点图模板。

在图表区域内单击右键以修改刻度。接下来，加载对照样品。在自动进样器窗口中，选择“prime”，进入“文件”菜单，单击“打开脚本”以选择正确的内置脚本，然后单击“确定”。

进入采样器软件菜单中的孔板模板，选择需要分析的孔。将孔板加载并固定到自动进样器载台上后，在自动进样器窗口中点击“运行孔板”，提示时保存文件，然后在LPS软件窗口顶部功能区点击“存储当前数据”按钮，再次保存数据。打开LPS软件。

导航至文件并选择新建实验，然后返回文件并点击新建样本。创建一个散点图，以飞行时间为横轴，消光为纵轴。再创建另一个散点图，以飞行时间为横轴，红色信号为纵轴。

确保选中“启用激光”以激活488纳米和561纳米激光器。将对照样品管置于样品端口，然后在“采集与分配”对话框中点击“采集”。当系统提示时，务必保存文件。

当测量了足够数量的蠕虫以区分种群后，在显示飞行时间与消光程度的散点图中选择“中止”。在代表成虫种群的区域周围绘制一个门控。然后转到“视图”，单击“门控层级结构”，并确认荧光门控已正确列在成虫种群门控下方。

在飞行时间与红点图中，围绕高红值和低红值区域创建门控，以突出显示成虫中显示微生物群定植的感兴趣区域。设置优化后，进入文件菜单并点击保存实验，然后点击文件并选择保存样本。要加载收集装置，请选择加载A板，以使收集阶段移动到一个准备就绪的位置，便于加载收集管或96孔板。

若要将样品分配至96孔板，请进入设置部分，选择“板”（plates），然后点击校准板（calibrated plates）并选择96孔板。接下来，选择将线虫分选至的孔位，并输入每个孔中要分选的物体数量。同时务必指定感兴趣的门控区域。

若将多个门控区域分选至同一块孔板，请务必勾选标记为“每个孔设置门控”的复选框。单击“确定”以保存更改。完成分选数量设置并指定位置后，将样本加载到样本进样口，然后在采集与分液对话框中单击“填充孔板”按钮，开始向96孔板中进行分液。

与幼虫相比，成虫的延伸长度和飞行时间值更高。来自两天龄成虫的子代主要处于L1和L2阶段，而来自三天龄成虫的子代大多达到L3和L4阶段。当在大肠杆菌（E.coli）上培养时，第三天的飞行时间与延伸长度值较第二天有所增加。

在恶臭杆菌（ochrobactrum）上培养时，BH3和混合培养物中的秀丽隐杆线虫（cenor abdidas allegands）在飞行时间和延伸值方面表现出差异。与单独的恶臭杆菌BH3相比，混合条件下观察到更高的BH3定植水平。相反，绿色荧光值表明，与单独的OP50相比，混合条件下的OP50定植水平较低。

这些线虫在Y轴方向上分布高度集中，表明大多数线虫体内OP50的定植水平较低，而副球菌BH3的定植水平在群体中分布较为均匀。同时观察了副球菌BH3定植水平与宿主发育之间的关系，例如体密度以及繁殖模式的差异。在由两种微生物组成的群落中培养的三日龄成虫表现出广泛的RFP强度范围，表明该组内个体间副球菌的定植存在差异。

显示了来自高RFP门和低RFP门的15条经分选的单条线虫孔的RFP图像。最重要的是要记住在所有步骤中使用适当的对照，以确保实验方案和仪器正常工作。在实时操作中，可利用具有特定特征的动物从宿主或微生物突变体库中分离菌株，以鉴定调控微生物感染后相互作用的基因。

分离的动物也可用于单个动物或富集表型池的下游分析，例如 RNA-seq 等。实际上，应用前景极为广阔。