通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化

该方法可在微流控通道内产生用户自定义的微生物排列模式。形成图案后，可对微生物进行监测，以高通量方式评估其长期生理特性及相互作用。利用毛细作用力可实现非特异性的图案化途径，适用于多种不同类别的材料。

例如胶体颗粒和细菌。此外，该方法能够制备出具有精确空间排布的大规模阵列。迄今为止，我们已在胶体颗粒和微生物细胞上测试并应用了该方法。

因此，它可应用于材料工程以及需要定量单细胞分析的领域，如药物筛选。首先，通过将弹性体与其交联剂混合来制备PDMS混合物。然后剧烈搅拌混合物，使两种组分均匀混合，直至产生气泡且PDMS混合物呈现不透明状。

现在，将混合物置于真空干燥器中脱气，直至所有气泡被去除，混合物重新变得透明。为了获得厚400微米的微流控芯片模板底层，将3克该混合物倒入硅模具上，并将硅模具置于旋涂仪上，以21 ×g 旋转5秒，再以54 ×g 旋转10秒进行旋涂。再次按照前述方法脱气，以去除截留的气泡。

将20克PDMS混合物倒入3D打印模具中，以制作将作为微流控芯片顶部的微通道，并如前所述抽真空30分钟。将硅片和3D打印模具在70摄氏度下烘烤至少两小时，然后沿3D打印模具的轮廓切割PDMS并剥离。用刀片在微通道周围切割PDMS，并打孔作为微流控通道的入口和出口。

现在切割PDMS，将其从硅模板上剥离，并将PDMS层切成与将要键合在模板上方的微流控通道相同尺寸的小片。用1%的洗涤剂溶液轻轻擦拭模板和微通道5分钟，然后用去离子水冲洗。接着，先用异丙醇冲洗模板和微通道，再用去离子水冲洗。

现在用一巴压力的压缩空气在室温下干燥模板和微通道一分钟。将模板和微通道放入等离子清洗仪中，使键合面朝上。开启等离子清洗仪后，对模板和微通道进行40秒的等离子处理，然后立即从等离子清洗仪中取出，并迅速将微通道键合到模板上方。

将微流控芯片置于70摄氏度的烘箱中保存五天，以确保PDMS恢复疏水性。实验当天，需在实验开始前数小时将培养箱预热至37摄氏度，随后在显微镜载物台上安装注射泵和加热玻璃板，并将温度设定为与培养箱相同。实验开始前90分钟，将微流控芯片放入盛有100%乙醇的容器中，用100%乙醇冲洗通道至少10分钟，然后将芯片置于真空干燥器中脱气，至少持续30分钟。

现在用蒸馏水替换乙醇，并对芯片进行至少30分钟的真空处理。将微流控芯片放入70摄氏度的烘箱中加热10分钟，以去除通道中残留的任何液体。用移液器将1毫升MOPS培养基加入离心管中，并加入10微升0.132摩尔的磷酸钾溶液。

取100微升过夜培养物加入离心管中，在2,300 × g条件下离心2分钟。轻柔弃去上清液，将沉淀重悬于1毫升含0.015%吐温20和0.01%磷酸钾的新鲜MOPS培养基中，并将菌液悬液装入1毫升注射器中。为确保注射器与管路连接牢固，可直接将针头插入管路。

现在将注射器安装到注射泵上，并通过通道上游部分的入口将悬浮液注入微流控芯片，直至悬浮液覆盖带有捕获结构的模板区域。将注射泵设置为0.07至0.2微升/分钟的流速，回吸细菌悬浮液，并通过显微镜软件监测图案形成过程。一旦细胞在模板上完成排列，即提高回吸流速，迅速排空微流控通道，并用已预先脱气至少30分钟并预热至30摄氏度的新鲜LB培养基冲洗通道。

将注射泵的流速设置为每分钟2 µL，以缓慢冲洗通道。待通道完全充满后，再次提高流速。在所需的放大倍数和时间间隔下采集正在生长的细菌图像。

用移液器将900微升0.015% Tween 20水溶液加入离心管中，然后向其中加入100微升原始胶体悬浮液。将悬浮液在13,500 × g条件下离心1分钟，并轻轻用Tween 20水溶液替换上清液。将胶体悬浮液吸入1毫升注射器中，再通过微流控管路将注射器连接至芯片。

通过通道上游中央区域的入口将悬浮液注入微流控芯片，缓慢推动悬浮液，直至覆盖模板。以每分钟0.07至0.2微升的流速回撤胶体悬浮液，并通过显微镜软件观察图案化过程。当弯月面快速到达模板末端时，提高流速。

利用直通道结构实现了荧光标记的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞在固定相中的图案化排列，在分析的5,000个捕获陷阱中，有83%成功沉积了细胞。当通道中注入新鲜LB培养基后，图案化的细菌在1.5小时内不同时段恢复生长。一旦恢复生长，单个细菌细胞开始各自形成独立的菌落，并持续扩展直至形成连续的表面层，此时单细胞分辨率丧失。对55,000个捕获陷阱的分析显示，由直径为2微米和1微米的颗粒组成的绿色-红色二聚体，分别在93%和89%的分析陷阱中形成。

在52%的捕获点中形成了绿-红-绿三联体结构。通过在相反方向进行两次沉积，可精确控制图案化颗粒之间的距离，从而将这些颗粒捕获在每个捕获点的相对两端。在图案化过程中，确保模板温度均匀非常重要，以防止发生冷凝。

为此，我们在模板下方放置一块加热的玻璃板，并将其温度设置为与培养箱相同。该方法可应用于涉及定量单细胞分析的多种生物学研究。其独特优势在于高通量特性，可在同一实验环境中实现数千个细胞的图案化，从而提供充足的统计学数据。