微孔阵列平台中微生物群落构建与追踪

本方法的总体目标是利用硅质微孔阵列，在受限环境中对多成员微生物群落进行高通量并行分析。该技术的主要优势在于，能够对在工业、医学和环境领域具有重要意义的、高度局域化的微生物相互作用进行高通量、高度并行的筛选。该方法有助于回答生物医学和微生物生态学领域的关键科学问题，例如：在精细尺度下固有的空间限制如何驱动群落发育的确定性与随机性参数？这些限制对微生物成员的丰度和空间组织会产生哪些关键影响？

首先准备微孔阵列。使用金刚石刻划笔从印有多个阵列的硅片上切割出单独的微孔阵列芯片。每个单独的芯片包含多个子阵列，孔径范围为5至100微米，并具有三种不同的间距密度。

每张芯片上，完整的孔阵模式也重复四次。接下来，使用移液器吸头盒和经 PBS 浸润的擦拭纸制作一个湿化室。然后向每张芯片上加入 150 微升 BSA 溶液液滴，并将芯片置于盒中，在室温下孵育 1 小时。

同时准备细菌。将菌液离心沉淀，然后用500微升含2%甘油的新鲜R2A培养基重悬。随后在600纳米处测定菌液密度，并将浓度调整至光密度为0.02。

芯片孵育后，移除 BSA 溶液，并用 PBS 清洗芯片三次。清洗后，用氮气将芯片吹干，并放回湿化孵育盒中。接着，向每片干燥的芯片加入 150 微升培养悬液，在 4 摄氏度条件下孵育 1 小时，使细菌有足够时间黏附至微孔中，同时可减缓任何潜在污染物的细胞分裂。

为准备用于成像的芯片，首先为每个芯片制备一块琼脂糖包被的盖玻片。将少量琼脂糖溶解，每个盖玻片约需五毫升。接着，用乙醇清洗盖玻片的一面，并将清洗面朝上，居中放置于载玻片上。

然后将两个厚度为1毫米的PDMS垫片沿盖玻片的长边放置，并移动盖玻片，使其一端伸出载玻片1毫米。接着，将足量的琼脂糖溶液倒入盖玻片上，使其完全覆盖盖玻片表面。随后，用另一块玻璃载玻片将琼脂糖压平，形成均匀的厚度。

同时制备多个此类载玻片组件。当琼脂糖开始凝固时，将组件转移至 4 摄氏度环境中。冷却 15 分钟后，切除盖玻片周围多余的琼脂糖。

然后，将组件放入培养皿中，并在4摄氏度下保存。芯片与细菌孵育后，依次将芯片浸入超纯水中，每次10秒。接着将湿润的芯片边缘朝下放置在纸巾上，直至大部分液体流尽。

现在，去除未沉入孔中的细菌。剪一段与硅芯片等长的胶带，将其粘附在硅片的聚对二甲苯涂层上。然后撕下胶带以去除聚对二甲苯涂层，并立即准备将芯片倒置。

现在，将芯片放置在载玻片组件上，使微孔与琼脂糖接触。一旦芯片与琼脂糖接触后，务必小心不要移动或错位芯片。接着，将整个组件转移至显微镜载物台环境控制腔室的载片架中，并在接下来的24小时内，以所需的间隔时间在10倍放大倍数下采集延时图像。

使用常规的免费软件处理图像堆栈。首先，导入图像序列。对于平均化处理，加载校正图像或暗场图像。

然后进行背景减除。提供一个半径值，例如 135 像素，并选择滑动抛物面法。接下来，通过选中两张图像并使用减法操作，从平均照明场图像中减去平均暗场图像。

现在，按如下步骤进行照明校正。将操作模式设为除法，将 i1 设为孔板图像，将 i2 设为校正图像，将 k1 设为校正图像的平均值，将 k2 设为零。然后单击“创建新窗口”。

为了定量微孔中的细菌生长情况，首先使用微阵列插件选择感兴趣区域。在地图菜单中，点击重置网格，并指定行数、列数和孔径大小。然后从 ROI 形状菜单中选择圆形。

为了将ROI阵列与图像对齐，可按住ALT键或ALT+SHIFT键，然后用鼠标选择ROI阵列的左上角ROI进行移动。要调整ROI的大小，请在选择ROI阵列右下角的同时按住Shift键。要调整ROI之间的间距，请在拖动阵列的顶部或底部边缘时按住Shift键。

当 ROI 阵列与图像中的孔位对齐后，点击“测量 RT”。随后将输出一个包含每幅图像或每个时间点所有测量数据的表格，该表格可复制到电子表格中进行分析。本实验比较了两种铜绿假单胞菌菌株的生长情况。其中一种菌株组成型表达与 VI 型分泌系统相关的毒性效应蛋白。

另一种由于功能丧失而易感六型致病性。两者分别表达不同的荧光蛋白。对共培养体系进行了不同孔板尺寸的长期研究。

细菌被单独培养以及共同培养。在20小时的生长过程中，每30分钟进行一次成像。对成像数据进行软件校正后，绘制了定量的生长轨迹。

在共培养条件下，数据并未显示出生长状态有显著变化。为了进一步分析，将每条生长曲线拟合至一个包含三个参数的修正逻辑斯蒂函数：最大信号值、最大生长速率和延滞时间。该分析表明，这两种物种的共培养对其总体生长几乎没有影响，生长曲线中观察到的变异很可能源于环境因素。

一旦掌握，若操作得当，该装置的搭建仅需数小时即可完成。在进行此操作时，必须使用生长旺盛的细胞，以准确调节最终的细胞OD值，从而在芯片组装中形成均匀的金环层；同时，在聚对二甲苯剥离步骤中需格外谨慎。通过该方法，可借助遗传物质分析，回答诸如基因表达如何随群落组成和空间排列变化而变化等问题。

请注意，操作铜绿假单胞菌可能存在潜在危险，因此在进行本实验时，应始终佩戴手套、实验服、护目镜，并采用适当的无菌操作技术。