利用圆二色光谱研究DNA-蛋白质相互作用
2022年2月10日
利用圆二色光谱法描述了ATP依赖性染色质重塑因子与DNA配体之间的相互作用。通过产生的峰分析基因启动子上发生的诱导构象变化，可用于理解转录调控的机制。
该方案使我们能够观察由ATP依赖性染色质重塑蛋白诱导的DNA二级结构变化。DNA结构的改变可与转录调控相关联。这是一种简便且高灵敏度的技术，仅需极少量的纯化DNA即可记录寡核苷酸的结构变化。
该方法可用于研究由ATP依赖性染色质重塑蛋白介导的转录调控。首先，新鲜配制缓冲液及其他反应组分的工作浓度，并在反应体系建立前置于4摄氏度保存；随后，使用NADH偶联氧化法测定蛋白质在不同DNA分子存在下的ATP酶活性。在96孔板中混合0.1毫摩尔的ADAAD、2毫摩尔的ATP、10纳摩尔的DNA以及1倍浓度的REG缓冲液，最终体积为250微升。
接下来，在37摄氏度的培养箱中孵育反应30分钟，然后使用随酶标仪提供的软件测定NAD+的含量。为测量340纳米处的吸光度，点击NADH检测程序，将96孔板放置在仪器的板架上，然后点击读板按钮以记录吸光度。使用高透光石英比色皿采集CD光谱。
使用矩形或圆柱形比色皿。清洁比色皿时，先用清水冲洗数次，然后对装有水或缓冲液的比色皿进行扫描，以检查是否清洁干净。实验反应中应使用经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的DNA寡核苷酸。
快速冷却时，将DNA在加热块上于94摄氏度加热3分钟，然后立即置于冰上冷却。缓慢冷却时，在94摄氏度加热DNA 3分钟后，使其以每分钟1摄氏度的速率冷却至室温。为记录基线光谱，依次在1.5毫升离心管中设置总共五个对照反应。
所有反应中均保持反应体积为 300 微升。为记录 CD 谱图，依次在 1.5 毫升离心管中设置共计五个实验反应。为记录扫描，打开气体并启动 CD 圆二色光谱仪。
10 到 15 分钟后，打开光源，启动水浴，并将样品池 holder 的温度设置为 37 摄氏度。接着，打开 CD 谱图软件，将温度设为 37 摄氏度，波长范围设为 180 至 300 纳米，每数据点采集时间为 0.5 秒，扫描次数设为 5 次，然后点击 pro data viewer，新建一个文件，并根据实验细节和日期重命名该文件。随后，用移液器混合基线反应和实验反应液，小心地将各反应混合液逐一转移至比色皿中，确保无气泡产生。
若进行时间进程实验，将反应体系在37摄氏度下孵育所需时间后，进行扫描。向含有DNA、ATP、镁离子和蛋白质的缓冲液中加入EDTA，以终止ATP水解反应。为完全抑制ATP酶活性，可提高EDTA浓度并延长孵育时间。
在软件中从相应的反应中减去基线，并在圆二色光谱软件或数据绘图软件中对数据进行平滑处理，然后绘制波长对平均残基椭圆率的图谱并分析峰形。M-fold 分析显示，MYC DNA 的两条链均可形成类似茎环的结构。此处展示了包含 G-四链体 GECE 的正向和反向 DNA 序列的 M-fold 结构。
在无ATP和ADAAD以及有ATP和ADAAD存在的情况下，快速冷却的GECE的圆二色光谱显示，ADAAD诱导出两个正峰，一个位于258纳米，另一个位于210纳米。加入EDTA后，这种构象变化被消除。此时圆二色光谱在210纳米处呈现一个负峰，以及一个在230纳米和250纳米处有峰的宽正带。
QGRS mapper 和 M-fold 分析显示，DROSHA、DGCR8 和 DICER 的启动子区域具有形成 G-四链体和茎状结构的潜力。DROSHA 第五对的 CD 光谱显示，ADAAD 在 210 纳米处诱导出一个负峰，在 260 纳米处诱导出一个正峰。该光谱是 A-DNA 的特征。
DGCR8 配对一的圆二色光谱在 210 纳米处显示一个正峰，在 260 纳米处显示一个宽的负峰。该光谱是 B 型向 X 型转变的特征。对于 DGCR8 配对七，在 210 纳米和 270 纳米处观察到明显的正峰，在 250 纳米处观察到负峰。
该光谱是平行G-四链体DNA结构的特征。最后，对于DICER配对一，观察到在210纳米处有一个正峰，在230纳米和260纳米处有两个负峰。这些峰是A型向X型DNA转变的特征。
确保DNA和蛋白质的纯度达到99%或更高。比色皿应保持洁净，基线应低于1毫度。所有试剂均需高纯度，以确保背景信号低于1毫度。
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概述
本研究利用圆二色光谱法描述了ATP依赖性染色质重塑因子与DNA配体之间的相互作用。在基因启动子上观察到的构象变化可为转录调控机制提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 染色质重塑
- 转录调控
- 结构生物学
背景
- ATP依赖性染色质重塑因子在基因表达中起着关键作用。
- 理解DNA构象变化对于阐明转录机制至关重要。
- 圆二色光谱法是分析DNA结构的一种灵敏技术。
- 少量DNA即可用于详细的结构研究。
研究目的
- 观察染色质重塑蛋白诱导的DNA结构变化。
- 将结构变化与转录调控相关联。
- 提供一种利用圆二色光谱法研究这些相互作用的实验方案。
使用的方法
- 缓冲液和反应组分工作浓度的配制。
- 在不同DNA分子存在条件下测定ATP酶活性。
- 使用NADH偶联氧化法检测。
- 在96孔板中混合特定浓度的ADAAD、ATP、DNA和REG缓冲液。
主要结果
- 利用圆二色光谱成功观测到DNA的结构变化。
- 建立了DNA结构与转录调控之间的相关性。
- 该方法被证明操作简便且高度敏感。
- 获得了关于ATP依赖性染色质重塑蛋白作用的新见解。
结论
- 该研究加深了对转录调控机制的理解。
- 圆二色光谱是分析DNA构象变化的有效工具。
- 未来的研究可在此基础上进一步探索染色质动态。
常见问题
执行层面的行业相关性
圆二色光谱（CD）技术能够高灵敏度地检测染色质重塑蛋白诱导的DNA构象变化，直接为早期发现阶段的靶点验证和机制去风险化提供依据。该方法可提升转录调控研究的预测可信度，有助于在生物制药研发管线的关键转折点做出基于风险评估的决策。由于其样品需求量少且具有定量输出，该技术可作为广泛筛选DNA-蛋白质相互作用的可扩展工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够直接观察蛋白质结合后DNA结构的变化，阐明调控机制。
- 通过将构象变化与转录结果关联，支持染色质重塑因子作为药物靶点的功能验证。
- 通过区分序列特异性与亲和力驱动的相互作用，实现机制层面的风险降低。
- 提供定量数据，用于基于假设的候选靶点优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 提供可重复、定量的DNA-蛋白质相互作用动力学读数，用于检测方法的标准化。
- 通过验证生物系统的准备状态并最小化背景噪声，支持稳健筛选平台的开发。
- 实现对突变DNA序列的快速评估，以探究特异性并优化检测条件。
- 由于对样品和仪器要求极低，可促进平台在多种靶标类别间的重复使用。
转化与临床前研究
- 通过模拟与转录调控相关的基因启动子区域的染色质动态，与疾病相关系统相一致。
- 通过实现结构生物标志物的鉴定，为从发现到临床前验证的连续性研究提供支持。
- 通过关联体外构象变化与潜在的体内调控效应，支持基于风险评估的推进策略。
流程与工作流整合
CD 圆二色光谱通过实现对 DNA-蛋白质相互作用的早期机制研究、检测方法开发以及转化生物标志物探索，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology： 通过可视化DNA构象变化，支持染色质重塑和转录调控的假设验证。
- Screening： 提供定量且可重复的光谱数据，用于比较不同条件和突变体下的蛋白质-DNA结合情况。
- Analytics： 输出波长分辨的椭圆率数据，实现对结构状态的统计学比较。
- Translational Research： 将体外构象特征与疾病相关的启动子动态关联起来。
- Enterprise Reuse： 提供标准化的低样本投入工作流程，可适用于多种基因靶标和蛋白质类别。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低染色质生物学中的机制模糊性。
- 操作价值：以最少的样本需求提供标准化、可扩展且可重复的测量结果。
- 战略价值：支持对早期阶段靶点做出明智的“推进/终止”决策，并实现资本高效的优先级筛选。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的转录调控项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 数据解读需要具备生物物理分析和染色质生物学方面的专业知识。
- 需要使用高灵敏度圆二色光谱仪，以及纯净、高纯度的试剂。
- 要求不同研究团队在样品制备和基线对照方面进行严格统一的标准化操作。
- 通过优化实验方案，可适用于多种DNA序列和染色质重塑蛋白。
- 受限于对高纯度DNA和蛋白质样品的需求，以尽量减少背景信号。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
ATPase Activity
1:35
Preparation of Circular Dichroism (CD) Cuvettes and DNA Oligonucleotides
2:19
Setting up the Experiments and Recording the Scan
4:10
Results: CD Spectra of MYC, DROSHA, DGCR8, and DICER Oligonucleotides in the Presence of ATP and ADAAD
6:18
Conclusion
