细胞突起力显微技术：一种量化细胞突起产生作用力的方法

本实验的总体目标是利用原子力显微镜定量测定细胞突起力。首先制备涂有特定配方的网格，并测量该薄膜的厚度。此过程的第三步是将细胞接种于网格上，并使其贴壁。

该实验步骤的最后一步是使用原子力显微镜对细胞下方的形变薄膜进行成像。当巨噬细胞黏附于基底时，会形成称为 podosome 的亚微米级黏附结构。最终，podosome 引起的薄膜形变将通过自主开发的力学模型进行量化，并转换为作用力。

将一块经乙醇清洁的玻璃片放入漏斗式成膜装置中，并盖住漏斗顶部。将明胶溶液倒入漏斗中，直至液面达到载玻片高度的三分之二处。静置一分钟，然后以稳定流速排净明胶溶液。

请注意，薄膜的厚度取决于流速和福尔马林溶液的浓度。轻轻拍干并用锋利的剃须刀片切出矩形。将载玻片浸入装有蒸馏水的烧杯中，使福尔马林膜漂浮到水面上。

将经丙酮清洁的载网小心地放置在薄膜上，光面朝上，并在其中一些载网上放置直径为12毫米的盖玻片。这些将用于厚度评估实验。最后，用贴有标签的载玻片浸入以回收整个薄膜和载网。

用镊子沿玻璃覆盖的盖片边缘划出轮廓，以切割Formvar膜并将其从载玻片上剥离。将网格位置置于覆盖的盖片下方，再用镊子勾勒网格轮廓，将其撕下。由此在Formvar膜上形成的孔洞将用于成像，以测量其厚度。

将硅氮化物悬臂安装在AFM玻璃块上，确保金色条纹不位于弹簧尖端下方。将玻璃块安装到AFM模块上，然后将该模块放置在显微镜载物台上。将涂有聚乙烯醇缩甲醛的盖玻片放入观察室，并在其上方加入PBS溶液。

在接触模式下，使用0.5纳牛的力扫描Fomvar与玻璃之间的边界。在数据处理软件中，以玻璃表面作为高度参考，测量横截面上Fomvar的厚度。在无菌操作台中取出一个12毫米的盖玻片，并在其上粘贴一条带孔胶带。

用镊子勾勒出覆有明胶膜的载网轮廓，并将其光面朝上放置，使其仅边缘与粘合剂接触。此举可防止在将载网从胶带上取下时明胶膜被撕裂。将盖片放入无菌的六孔板中，并用移液器加入10毫米的无血清培养基液滴。

样品应包含约10,000个细胞，此处为由人单核细胞分化而来的巨噬细胞。操作过程中切勿让移液器吸头接触载网，以免损坏聚乙烯醇缩醛（Fomvar）涂层。孵育30分钟使细胞贴壁，随后加入含血清的培养基补满孔板，再继续孵育2小时，然后进行原子力显微镜（AFM）观察。

在玻璃底培养皿上放置两条平行的双面胶带，确保两条胶带之间的宽度略小于您的网格直径。然后将先前接种了细胞的网格取下，细胞面朝下放置在两条胶带之上。再在上方贴上另外两条胶带，以固定网格。

加入预热并添加了 HEPES 的培养基至培养皿中。将培养皿放入已预设为 37 摄氏度的培养皿加热器中。将装置安装在原子力显微镜（AFM）载物台上。

当系统温度稳定在 37 °C 时，开始对 Fomvar 表面进行扫描，扫描应在接触模式下进行，设定点为 0.95 nN，并在偏转数据视图窗口中观察与原生动物相关的形变。以下是利用原子力显微镜（AFM）获得形貌并进行图形测量的代表性结果及处理步骤。如图所示，可在 Fomvar 表面上检测到隆起结构。

为了将该照片信息转换为力值，首先需要获取局部高度差。为此，应对扫描线独立地减去一个三次多项式拟合结果。然后，利用自主开发的专用图像算法，结合基于原生动物介导突起的力学模型，从原子力显微镜高度图中评估突起力的数值。

通过该实验步骤，我们能够研究原生动物中突起力生成所涉及的机制。感谢观看，祝您的实验顺利成功。