在氧化应激条件下研究上皮细胞在纤连蛋白上的细胞黏附与铺展动态过程

该方法将使研究人员能够量化锚定依赖性细胞在氧化应激条件下向细胞外基质蛋白纤连蛋白黏附及铺展的早期动态过程。该技术具有良好的通用性，可经调整用于在多种不同条件下研究细胞骨架的动态变化。此外，数据的采集与分析均使用常规实验室设备及免费软件完成。

了解细胞在氧化还原状态改变期间如何附着并铺展于细胞外基质（ECM）的机制，可为理解正常生理状态及疾病状态（如转移性癌症）提供重要见解。该方法可用于在不同细胞培养条件、锚定依赖性细胞系以及氧化剂存在下，研究细胞铺展与黏附，从而回答广泛的生物学问题。该技术需要多种试剂。

因此，所有溶液必须在实验开始前预先配制。在符合生物安全二级标准（BSL-II）的超净工作台中放置一个组织培养级的24孔板。将一片玻璃盖玻片放入每个孔中。

根据文字方案中的图1B标记培养板。随后，将500微升纤连蛋白溶液加入每个孔中。用移液器将溶液在每个盖玻片上反复吹打数次，以确保涂层均匀且盖玻片完全浸没。

将培养板盖上盖子，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。随后从培养箱中取出培养板，吸除各孔中的纤连蛋白溶液。

每次使用 500 µL 的 1× PBS 洗涤孔板，共洗涤三次。吸尽最后一次的 1× PBS，然后在 37 °C、5% CO₂ 条件下，用 500 µL 的 0.5% 去脂 BSA 溶液封闭孔板，时间不少于 15 分钟。首先，将所需溶液在 37 °C 水浴中预热。

在BSL-II级认证的超净工作台中，从一个10平方厘米培养皿中汇合的REF52细胞单层开始，用6毫升预热的1×PBS缓冲液洗涤细胞两次。随后在6毫升预热的去脂BSA溶液中对细胞进行至少1小时的无血清饥饿处理。接着，用6毫升预热的1×PBS缓冲液再次洗涤细胞。

吸去 PBS，加入 1.5 毫升预热的 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将细胞置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育约两分钟。在光学显微镜下观察细胞，以确认消化完全。

如果轻敲培养板后细胞仍然贴壁，将其放回培养箱中继续孵育额外两分钟。用移液器向培养皿中加入1.5毫升预热的胰蛋白酶中和液（TNS），以终止消化反应并收集已脱落的细胞。反复吹打培养板底部多次，确保所有残留的贴壁细胞均被完全吹下。

若细胞呈团块状，可通过移液枪轻柔地在培养皿背面反复吹打，进一步吹散细胞悬液。接着，使用台盼蓝排斥法在自动细胞计数仪中对细胞进行计数。取适量细胞，用去脂BSA配制细胞悬液，使细胞密度达到每毫升10,000至30,000个细胞，并将悬液置于15毫升锥形管中。

使用台式离心机中的固定角转子，以300 × g离心力离心细胞5分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于7 mL温热的去脂BSA溶液中。然后将细胞悬液等分为两份，分别加入两个15 mL锥形管中，一份用于溶剂对照组，另一份用于Ku55933处理组。

使用试管旋转仪，在37摄氏度的细胞培养孵育箱中将试管旋转90至120分钟。铺板前30分钟，向每根试管中加入Ku55933和DMSO，使其终浓度为10微摩尔。将细胞悬液放回旋转仪继续处理至剩余时间结束。

在接种细胞前，立即从培养箱中取出培养板，吸除脱脂 BSA 溶液。随后，从每个处理组中取出 500 µL 细胞悬液，分别加入 24 孔板中预先包被纤维连接蛋白的盖玻片上。继续在先前条件下培养培养板和细胞悬液。

然后让细胞在盖玻片上贴附所需的时间。达到预定的贴附时间后，吸去孔板中每个盖玻片上的细胞溶液。通过沿孔壁缓慢加入的方式，用移液器轻轻向每个盖玻片上加入500 µL的3.7%多聚甲醛溶液，静置10至15分钟。

接下来，移除多聚甲醛溶液，每张盖玻片用500微升1×PBS洗涤两次。吸去PBS，然后每张盖玻片加入500微升含0.2%Triton X-100的1×PBS，在室温下对细胞进行透化处理，持续10至15分钟。随后每张盖玻片用500微升1×PBS洗涤三次。

用500微升免疫荧光封闭缓冲液封闭每张盖玻片上的细胞，封闭时间为30至60分钟。将一抗抗paxillin抗体用封闭缓冲液按1:250的比例稀释，充分混匀后，向每张盖玻片加入200微升抗体溶液。

在室温下孵育至少一小时。之后，吸去抗体溶液，并用500 µL的1× PBS对每个盖玻片洗涤10分钟。从此步骤开始，避免样品暴露于光照下。

将与红色荧光染料 Alexa 594 偶联的鬼笔环肽-F-肌动蛋白探针以及山羊抗小鼠 488 荧光二抗加入相同的封闭缓冲液中进行稀释。充分混匀后，向每张盖玻片加入 200 µL 抗体溶液，孵育 30 分钟。吸除抗体溶液，再用 500 µL 1× PBS 对每张盖玻片洗涤 10 分钟。

吸去 PBS，用 500 微升去离子水冲洗盖玻片一次。然后使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂将盖玻片固定在载玻片上。经抗 paxillin 抗体固定与染色后，获取 REF52 细胞的荧光 8 位灰度图像。

完成所有图像处理步骤后，单个黏着斑应清晰突出、处于焦点中，并且彼此之间易于区分。将细胞接种于纤连蛋白后，采集抗paxillin和鬼笔环肽F-actin探针染色细胞的灰度荧光图像。在允许REF52细胞于纤连蛋白上贴附20至30分钟后，应能清晰观察到明显的黏着斑和应力纤维。

细胞膜前缘富含F-肌动蛋白的片状伪足用箭头标示。通过分析鬼笔环肽F-肌动蛋白探针和抗paxillin染色的类似荧光图像，计算细胞铺展过程中应力纤维所占百分比。值得注意的是，氧化剂处理导致在所有检测的黏附时间点应力纤维的形成显著增加，并且在细胞黏附于纤连蛋白15分钟后，细胞铺展程度下降。

较高的细胞密度接种会导致细胞拥挤，由于过度融合，细胞无法充分铺展。可见细胞边缘与相邻细胞难以区分。因此，无法对单个细胞进行定量分析，也无法准确测定铺展周长。

另取一株小鼠胚胎成纤维细胞系，将其悬浮后接种于纤维连接蛋白上孵育30分钟。随后固定细胞，并用抗paxillin抗体进行染色。注意观察失焦的细胞。

此外，抗paxillin抗体与细胞碎片的交叉反应会影响定量图像分析中的阈值设定，因此不应将其纳入分析。在图像处理过程中，使用Fiji中的查找工具检查图像直方图，同时调整亮度/对比度，以避免信号饱和相关的问题。黏附和铺展的变化可能影响细胞迁移。

用于追踪单细胞迁移、伤口愈合或趋化侵袭的实验方法可以确定迁移行为是否发生改变。Rho家族GTP酶通过其特定的空间-时间激活模式来调控细胞黏附动态。在氧化应激过程中，细胞黏附和铺展的表型变化可能提示这些蛋白具有下游调控作用。

该方法需要使用生物安全二级（BSL-II）细胞系和有害化学试剂。研究人员须接受所在机构环境健康与安全办公室规定的化学与生物安全培训。