人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化

本方案具有重要意义，因为它可用于在特定疾病状态下，于活细胞内从分子水平上观察和研究炎症性caspase通路。该技术的主要优势在于，能够用于鉴定原代免疫细胞中炎症性caspase激活复合物的组成成分、激活条件及其亚细胞定位。经过少量优化后，该方法可适用于其他原代细胞以及多种通过寡聚化激活的蛋白质，其应用不仅限于显微技术方法。

首先，吸除10厘米培养皿中完全分化的巨噬细胞的培养基，并用预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞单层，彻底去除所有培养基。每10厘米培养皿加入2毫升预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，消化细胞。用P-1000移液器轻轻吹打整个培养皿表面，使胰蛋白酶-EDTA溶液上下混匀，然后将细胞悬液转移至含有5毫升预热的完全培养基的15毫升锥形管中。

在明场显微镜下检查细胞是否已脱落，如有需要可再次进行消化。吸除培养基，将细胞重悬于10毫升预热至37°C的1×无菌PBS中。随后取20微升细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞数量。

每次转染取1 × 10⁵至2 × 10⁵个细胞，置于15毫升离心管中。加入预热的1×无菌PBS，调节终体积为15毫升。吸除PBS，再以250 × g离心1分钟。

使用 P-200 微量移液器去除细胞沉淀中的残留 PBS。每个转染样品取一支 1.5 毫升无菌微量离心管，在生物安全柜中加入相应的报告质粒和半胱天冬酶 BiFC 质粒。将移液器工作站、设备、枪头、电穿孔管和移液器放入无菌超净工作台中。

连接并启动核转染仪。在启动界面输入转染参数。点击“Voltage”（电压），输入1000，然后点击“Done”（完成），将其设置为1000伏特。

按下“宽度”，输入40，然后按“完成”以将脉冲设置为40毫秒。最后，按下“脉冲次数”，输入2，然后按“完成”以将电脉冲数量设置为2。取一支电穿孔管，加入3 mL室温的电解缓冲液E。

将电穿孔管插入移液工作站的移液管架中，确保管壁上的电极朝向内侧，并在插入时听到“咔哒”声。取细胞沉淀，每 1×10⁵ 至 2×10⁵ 个细胞加入 10 微升预热的重悬缓冲液 R，用 P-20 微量移液器轻轻混匀。将 10 微升细胞悬液加入每个转染管中，再用 P-20 微量移液器轻轻混匀。

将吸头插入移液器中，按压推按钮至第二档，确保夹具完全夹住吸头中活塞的安装杆。接着，将移液器的推按钮按至第一档，浸入含有细胞或质粒DNA混合物的第一根试管中，以吸取样品。然后，小心地将带有样品的移液器插入移液器架中，确保移液器发出“咔”声并正确放置。

按下触摸屏上的启动按钮，等待电脉冲完成传递。缓慢将移液器从设备上取下，并立即通过缓慢按压推杆至第一档，将截断的细胞悬液加入含有预热无抗生素培养基的相应孔中。轻轻摇动含有截断细胞的培养板，随后在湿润的组织培养孵育箱中孵育一至三小时，然后向每孔加入200微升预热的培养基。

将培养皿放入培养箱中，至少孵育24小时以进行基因表达。第二天，使用落射荧光显微镜检查细胞活力和转染效率。用P-1000移液器小心吸去细胞培养液，并沿孔壁加入500微升刺激溶液。

进行未处理对照孔实验时，加入不含刺激物的成像培养基。根据说明书开启显微镜和荧光光源，使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞。选择10倍或20倍物镜，将培养皿放置在显微镜载物台上。

使用目镜在568纳米滤光片下寻找细胞，聚焦于表达报告基因的红色细胞，计数视野中所有红色细胞。

在同一视野下，切换至488或512滤光镜，计数同时呈绿色的红色细胞数量。至少计数三个视野中不少于100个红色细胞。计算每个视野中Venus阳性横断细胞的百分比，并对每孔处理样本所得的百分比取平均值，以获得标准差。

使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对细胞成像时，通过相机在计算机屏幕上观察细胞的实时图像。利用操纵杆控制装置和调焦旋钮精细调节细胞的焦距和位置。设置512纳米或488纳米与568纳米激光器的激光功率百分比和曝光时间，使图像中的信号强度适中且无饱和现象。

开启实时采集并检查生成的图像，确保在两个通道的显示直方图中，每一层均可见明显的峰值。在观察细胞实时图像的同时，对每孔中表达mCherry或dsRedmito报告基因的一个或多个细胞，采集多张具有代表性的视野图像。经GM-CSF孵育七天的CD14阳性单核细胞在分化过程中表现出细胞形态的改变，从球形悬浮细胞逐渐转变为细长并完全贴壁的细胞，最终在完全分化后呈现更铺展的形态。

将完全分化的细胞转染含有caspase BiFC配对VC和VN，以及报告质粒dsRedmito，后者用于标记转染的细胞。未经处理的细胞未显示Venus荧光信号；而在尼日里菌素处理的细胞中，caspase-1 BiFC呈现为单个点状结构，具有典型的ASC小体形态。

对Venus阳性MDM的定量分析显示，在LPS联合尼日尔霉素处理组中，caspase-1 BiFC的阳性细胞比例最高。对caspase-1、4和5的前体BiFC配对质粒进行滴定实验，结果表明，转染400、500和1,000纳克质粒时，Venus阳性细胞比例最高。转染后24小时，使用20倍物镜获取的共聚焦图像显示，未处理的转染细胞仍具有活性，线粒体结构完整。

经血红素处理后，caspase-1 复合物呈现为单一的绿色点状结构，类似于尼日尔霉素诱导的点状结构。在细胞分化、转染和处理过程中，应避免剧烈条件和过度操作，以免导致caspase的自发激活和较高的背景激活水平。