由旁分泌来源的活性氧触发的血管钙²⁺信号转导的可视化

本实验的总体目标是观察由旁分泌来源的活性氧（ROS）引发的血管钙信号。首先利用氧化敏感性染料在活化巨噬细胞中观察ROS，此外还可通过基于质粒的荧光传感器在内皮细胞中检测ROS。

然后在共培养模型中同时观察被细胞示踪红染料标记的活化巨噬细胞和四标记的内皮细胞的荧光信号。最后，利用共聚焦成像系统，检测由巨噬细胞来源的活性氧触发的内皮细胞内钙信号。

这些结果可独立显示活性氧（ROS）水平，同时评估由游隼来源的活性氧触发的细胞内钙离子动员。该方法能够同时检测两种不同的信号分子，从而紧密模拟血管信号传导及病理生理环境。我实验室的两位博士后 Karthik 和 Raj 将演示在活性氧和钙离子测量以及巨噬细胞与内皮细胞相互作用中的实验操作流程。

在玻璃底35毫米培养皿中培养小鼠单核细胞来源的巨噬细胞。随后用Toll样受体激动剂刺激细胞，并在37°C下孵育6小时。用于可视化胞质中的目标结构。

加入对氧化敏感的染料，孵育细胞20分钟。随后在共聚焦成像系统的温控载物台上观察细胞。或者，若要观察经TLR激活的细胞中的线粒体活性氧，可加入线粒体超氧化物指示剂，并在37摄氏度下孵育细胞30分钟。

对于阴性对照，用 PBS 或 DMSO 处理细胞作为阳性对照。用 2 毫摩尔的抗霉素 A 处理细胞，并在共聚焦成像系统的温度控制载台上对所有细胞进行可视化观察。

使用 ImageJ 软件分析所有图像数据。该荧光探针可特异性检测亚微摩尔浓度的过氧化物，并且基于哺乳动物表达载体的设计，可将探针靶向定位于细胞质或线粒体。通过电穿孔法，构建稳定表达适当 Hyper 探针质粒的小鼠肺微血管内皮细胞系。

为促进菌落生长，将细胞以低密度接种于完全TMEM培养基中，37°C孵育48小时，随后更换为含有筛选抗生素的完全培养基。筛选出高比例超表达阳性细胞的克隆，并扩增培养以建立稳定超表达阳性细胞系，用于单独实验。将细胞接种于0.2%明胶包被的盖玻片上，过夜培养至80%汇合度。

现在用 TLR 配体激活细胞，并在 37 摄氏度下孵育六小时。为了检测胞质内活性氧，将细胞的盖玻片安装到 adelo 细胞培养小室中。加入一毫升预热的缓冲盐溶液，并将培养小室置于共聚焦成像系统的温度控制载台上。

记录细胞中荧光变化以检测线粒体活性氧（ROS）。加入两微摩尔的抗霉素A作为阳性对照。随后制备经处理细胞的盖玻片用于共聚焦显微镜观察。使用ImageJ软件进行图像分析。

将内皮细胞接种于明胶包被的玻璃盖玻片上，培养至80%融合度，用于观察和测量细胞内钙离子浓度变化。在室温下用荧光染料Fluo-4 AM孵育细胞30分钟，以尽量减少染料流失，随后用含有磺胺吡唑的实验成像溶液洗涤细胞。将盖玻片安装到容积为800 µL预热实验成像溶液的Adelo细胞腔室中，并将细胞置于共聚焦成像系统配备温控载物台的独立腔室内。

使用 500 纳克/毫升的细胞示踪红 C-M-T-P-X 在 15 分钟内标记待研究的巨噬细胞群体，洗涤细胞并将沉淀重悬于 200 微升的实验成像溶液中。然后将标记的巨噬细胞加入已装载荧光素 4:00 AM 的内皮细胞的共聚焦腔室组件中，每 3 秒记录一次绿色和红色荧光，持续 10 分钟。

在本实验中，J 7 74 0.1 细胞经 TLR 2、3 和 4 配体刺激 6 小时。代表性共聚焦图像显示，通过 DCF 检测到胞质内活性氧（ROS）水平升高。有趣的是，MitoSOX 红色荧光表明线粒体活性氧（ROS）也出现类似升高。

这些荧光变化具有定量性，因此结果必须进行归一化处理，并以每种处理的相对倍数变化表示。抗霉素A信号可作为线粒体活性氧（ROS）生成的阳性对照验证。该图显示了稳定表达hyper-Cyto或hyper-Mito的内皮细胞中细胞质和线粒体过氧化物水平的图像。

经TLR激动剂刺激的MP ECS。共培养系统中刺激6小时后，平均荧光变化的定量结果显示高细胞质荧光和高线粒体D荧光均增加。为评估Peregrine ROS信号通路，分别从野生型和GP 91 Fox基因敲除小鼠中新鲜分离镜像巨噬细胞，并用1微克/毫升LPS激活6小时。

用C-M-T-P-X将巨噬细胞标记为红色，并添加到绿色荧光标记的四型中。加载完成。MPM ecs。有趣的是，与来自GP 91 Fox基因敲除小鼠的巨噬细胞相比，来自野生型小鼠的LPS激活巨噬细胞在MPM ECS中引发了更大且更迅速的钙离子动员。

在进行该实验操作时，需注意长时间孵育或激光照射均会导致DCF发生自氧化。必须避免Hyper Cyto和Hyper D二尖瓣的光漂白。若操作得当，掌握RA测量技术后，可在巨噬细胞和内皮细胞中于七小时内完成检测。