人源单核细胞衍生巨噬细胞中Caspase激活的可视化

在免疫细胞中，caspase-1 是一种炎症性caspase，作为关键的免疫应答组分，以无活性形式存在。这些无活性形式由与催化结构域融合的前结构域组成，可被激活而转变为活性形式 通过 邻近诱导二聚化

可视化半胱天冬酶激活 体内 首先准备表达红色荧光蛋白以及一对荧光互补报告蛋白的转染人单核细胞来源巨噬细胞培养物。该报告蛋白由caspase-1的前体结构域与Venus蛋白的非荧光片段（Venus-N或Venus-C）融合而成。

使用含有脂多糖（一种细菌来源的炎症刺激剂）和钾离子载体——尼日利亚菌素的成像培养基处理细胞。

脂多糖与巨噬细胞上的模式识别受体相互作用，启动炎性小体复合物的组装。

尼日里菌素分子进入细胞并与钾离子结合，导致钾离子外流至细胞外环境，从而降低细胞内钾离子浓度。这会引发炎性小体感受器蛋白与衔接蛋白的活化——衔接蛋白作为感受器蛋白与前体半胱天冬酶-1之间的桥梁蛋白，进而形成复合物。

含有Venus片段的前结构域与复合物的衔接蛋白相互作用。这使得两个片段相互靠近，迫使其重新折叠并发出荧光。

在落射荧光显微镜下观察细胞。

转染的细胞呈红色，并有绿色荧光斑点，证实了caspase的激活。

每个转染反应取一个1.5毫升的无菌微量离心管，在生物安全柜中加入相应的报告质粒和caspase-BiFC质粒。将移液器工作站、设备、枪头、电穿孔管和移液器放入无菌超净工作台中。连接并开启核转染设备。

在启动界面中输入转染参数。点击电压，输入1,000，然后点击完成，将其设置为1000伏特。点击脉宽，输入40，然后点击完成，将脉冲设置为40毫秒。最后，点击# 脉冲，输入2，然后点击完成，将电脉冲次数设置为2次。

取一个电穿孔管，加入3毫升室温的电解缓冲液E。将电穿孔管插入移液工作站的移液管架中，确保管壁上的电极朝向内侧，插入时应能听到咔嗒声。

取细胞沉淀，每 1 至 2 × 10⁵ 个细胞加入 10 µL 预热的重悬 R 缓冲液，用 P20 微量移液器轻轻混匀。将 10 µL 细胞悬液加入每个转染管中，用 P20 微量移液器轻轻混匀。按下 Push 按钮至第二档，将吸头插入移液器，确保夹具完全夹住吸头内活塞的安装杆。

接下来，将移液器上的Push按钮按至第一档，插入含有细胞或质粒DNA混合物的第一支试管中，以吸取样品。将带有样品的移液器非常小心地插入移液器支架中，确保移液器发出“咔”声并正确就位。在触摸屏上按下Start，等待电脉冲完成传递。

缓慢地将移液器从支架上取下，并立即通过缓慢按压Push按钮至第一停点，将转染后的细胞悬液加入含有预热无抗生素培养基的相应孔中。轻轻摇动含有转染细胞的培养板，在湿润的组织培养孵育箱中孵育一至三小时。然后，向每孔中加入200微升预热的培养基。

将培养皿放入培养箱中，至少孵育24小时以进行基因表达。次日，使用落射荧光显微镜检查细胞活力和转染效率。

使用 P1000 移液器小心地从细胞中移除培养基，并沿孔壁加入 500 微升刺激溶液。对于未处理的对照孔，加入不含刺激物的成像培养基。

使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞时，按照制造商的说明打开显微镜和荧光光源。选择10倍或20倍物镜，将培养皿放置在显微镜载物台上。

使用目镜在568纳米滤光片下找到细胞，并聚焦于表达报告基因的红色细胞。计数视野中的所有红色细胞。在同一视野下，切换至488或512滤光片，计数同时呈绿色的红色细胞数量。至少计数三个视野中不少于100个红色细胞。