软物质纳米压痕的实验与数据分析流程

本方案提供了使用市售纳米压痕仪测量水凝胶和细胞刚度的逐步操作指南，并介绍了一款开源软件，用于可重复地分析所获得的数据。该方案使我们能够获取类似原子力显微镜的数据，但复杂性却大大降低。因此，本方案不仅对研究健康与病变样品力学特性的科研人员具有实用价值，我们相信其在软材料纳米压痕研究领域也具有更广泛的应用前景。

开启仪器并安装实验所选探头后，开始校准探头。在主软件窗口中点击“初始化”。在出现的校准菜单中，于输入框内填写探头信息。

接着，用与样品皿相同的培养基填充一个底部平坦的厚壁玻璃培养皿，并将培养基的温度调节至与样品一致。然后，将校准皿置于探针下方。进行液体中校准时，用移液器尖端轻轻接触玻璃卡套，在探针上滴加一滴70%乙醇或异丙醇进行预润湿，使液滴流过悬臂和球形探头尖端。

然后，手动将纳米压痕仪的机械臂向下移动，直至探针完全浸入液体中，但仍远离培养皿底部。等待五分钟，使液体达到平衡状态。接下来，在软件的“初始化”菜单中，点击“扫描波长”。

干涉仪的屏幕将显示一个进度条。通过导航至干涉仪设备上的“波长扫描”面板，检查光学扫描是否成功。然后，在初始化菜单中，单击“查找表面”以逐步降低探头。

当探针接触到玻璃培养皿时，会停止移动。探针与表面接触后，使用主软件窗口上的 y 轴向下箭头按钮将探针向下移动一微米。在实时窗口中观察绿色信号，注意每次一微米步进时基线的变化。

然后，从“初始化”菜单中点击“校准”。校准完成后，在弹出窗口中检查旧的和新的校准因子。如果新的校准因子处于文中所述的正确范围内，请点击“使用新因子”。

接下来，将压电陶瓷升高 500 微米。然后，通过进入干涉仪桌面的解调选项卡，检查解调圆是否已正确校准。轻轻敲击光学平台或纳米压痕仪，以引入足够的噪声。

离散的数据点组成的白色圆形应大致覆盖红色圆形。将含有样品的培养皿放置在显微镜载物台上，并手动移动纳米压痕仪的探针至样品上方的预期位置。在溶液中滑动探针时，注意使探针与样品表面之间保持一到两毫米的距离。

等待五分钟，使探针在溶液中达到平衡。使用光学显微镜对准探针。为测量软材料的杨氏模量，点击“配置实验”。

添加一个“寻找表面”步骤，并以位移控制方式进行单次压痕，以确定后续自动矩阵扫描所用的实验参数。如果单次压痕成功，则设置包含50至100个点、间距为10至100微米的矩阵扫描。在确认已勾选“自动寻找表面”选项后，单击“使用载物台位置”，以从当前载物台位置开始矩阵扫描。

在位移控制下设置矩阵扫描程序。将段数保持为五段，并使用默认的位移程序。如有必要，可修改每一段斜坡的位移程序及其持续时间。

切勿超过每秒10微米的应变率。将配置好的实验保存到所需的实验路径中。单击“运行实验”，然后等待实验完成。

当所有数据采集完成后，按照文中所述清洁探针并关闭仪器。若需筛选力-位移曲线并生成JSON格式的清理后数据集，请在实验室计算机的命令行中启动 prepare.py。

从下拉列表中选择 Optics11 数据格式。如果数据未正确加载，请重新启动图形用户界面并选择 Optics11 Old。然后，点击加载文件夹，选择包含待分析数据的文件夹。

使用图形用户界面上右侧的选项卡清理数据集。然后，点击“保存 JSON”，并为清理后的数据集输入适当的名称。如果与当前计算机不同，请将 JSON 文件发送至已安装 NanoAnalysis 软件的计算机。

从命令行启动 nano.py 文件。在图形用户界面的左上角，单击“加载实验”并选择 JSON 文件。

这将填充文件列表和原始曲线图，以力-位移曲线的形式显示数据集。在统计框中，检查三个参数的数值：激活数量（N activated）、失败数量（N failed）和排除数量（N excluded）。如需更详细地查看某一条特定曲线，可点击该曲线。

这将使其在曲线图中以绿色高亮显示。选择单条曲线后，统计框中的 R 和 k 参数将自动填充。在进一步清理数据集后，使用过滤框中提供的滤波器对曲线中的噪声进行过滤。

然后，在当前的曲线图中检查经过滤的曲线。经过滤的曲线以黑色显示，未经过滤的曲线则以绿色显示。为确定接触点，请在“接触点”框中选择软件中已实现的一系列数值方法之一。

根据文中的说明，调整算法参数以适应数据集，确保正确确定接触点。要查看单条曲线上接触点的识别位置，可通过单击选择该曲线，然后点击“检查”。

查看弹出的窗口，确认接触点的位置。然后，点击赫兹分析。这将生成三幅图。

检查数据集中每条曲线的力-压痕数据，同时查看以红色显示的平均赫兹拟合结果。然后，检查带有误差带（显示一个标准差）的平均力-压痕曲线，以及以红色显示的平均赫兹拟合结果。接下来，检查由赫兹模型对每条单独曲线拟合得到的杨氏模量的散点图。

检查结果框中计算出的平均杨氏模量及其标准偏差，确保其对于当前实验而言是合理的。然后，在保存框中，点击赫兹（Hertz）。在弹出窗口中输入文件名和目录，然后点击保存。

将创建一个 tsv 文件。在任何其他软件中打开该 tsv 文件以进行统计分析和进一步绘图。对于细胞纳米压痕数据，点击弹性谱分析。

检查生成的两个图，即每条曲线的杨氏模量随压痕深度变化的关系图，以及通过双层模型拟合的平均杨氏模量随压痕深度变化的关系图。分析完成后，点击“保存”框中的 ES。这将导出一个 tsv 文件到指定目录，该文件可用其他任意软件打开并作图。

成功的实验结果表现为力-位移曲线的接近段具有清晰、平坦的基线、过渡区域和斜坡区域。使用 NanoPrepare 可轻松将偏离该形状的曲线从数据集中剔除。此处展示了软质聚丙烯酰胺水凝胶和硬质水凝胶的平均力-压痕曲线及其对应的平均赫兹模型。

通过绘制杨氏模量的各个数值，获得了两种水凝胶的预期平均杨氏模量。对于细胞纳米压痕实验，平均力-压入深度曲线及相应的平均赫兹模型表明，赫兹模型无法完全描述随着压入深度增加，细胞纳米压痕实验中力的变化趋势。此处展示了拟合至200纳米压入深度的平均弹性模量谱。

平均弹性谱在压痕深度为200纳米时开始上升，表明基底对所测得的表观杨氏模量产生了影响。因此，选择200纳米作为赫兹模型和双层模型的拟合范围。如正文所述，对双层模型进行拟合可提取更多关于细胞力学状态的信息，包括细胞肌动蛋白皮层厚度、细胞肌动蛋白皮层模量以及细胞整体模量。

在杨氏模量分布方面，赫兹模型与弹性谱方法的直接比较显示出分布重叠且均值相近，证明了弹性谱方法的可行性。准确定位接触点，并在待比较的数据集之间保持所选算法参数的一致性，对于获得可靠的样品间比较结果至关重要。该方法具有广泛的适用性，可用于量化生物样品的局部弹性特性，包括球状体、类器官、组织以及通常意义上的所有软物质。