ACT1-CUP1检测确定芽殖酵母剪接体突变体对底物特异性的敏感性

ACT1-CUP1 检测可用于判断某种突变是否影响前体信使RNA的剪接过程，并提示受该突变影响最显著的剪接步骤。ACT1-CUP1 检测将剪接因子的突变与其对复杂剪接过程的影响关联起来，其检测结果通过简单的生长表型读出，具有较宽的灵敏度范围。

进行ACT1-CUP1检测时，高效利用时间至关重要。应首先对五到十个菌株进行检测，以尽量减少应激诱导的生长异常。本次实验流程将由我本人以及我实验室的本科研究人员Isabelle Marasigan共同演示。

首先，向每个瓶子中加入 790 毫克琼脂和一个搅拌子。在一个大烧杯中，为所有待倒制的铜板准备缺乏亮氨酸的生长培养基。每块平板需加入 265 毫克酵母氮源基础培养基、64 毫克缺乏亮氨酸的营养缺陷型混合物以及 34 毫升去离子水。

搅拌至溶解。然后，向每个已准备好的100毫升培养瓶中加入34毫升亮氨酸缺陷型生长培养基溶液，并用铝箔封口。接下来，使用高压灭菌锅推荐的液体程序进行高压灭菌，以达到灭菌并溶解琼脂的目的。高压灭菌后应尽快向每个培养瓶中加入4毫升20%葡萄糖溶液。

然后，将试管标签与瓶子标签对应，将每种硫酸铜的2毫升稀释液分别加入相应的瓶子中。使用摇床混合约30秒，然后将35毫升溶液倒入已标记的培养皿中，注意避免产生气泡。针对每种酵母菌株，向无菌的50毫升锥形管中加入9毫升亮氨酸缺陷型生长培养基和1毫升20%葡萄糖。

使用无菌接种针或移液器吸头，挑取少量酵母菌落接种至培养基中。随后，将所有过夜培养物在30摄氏度、180转/分钟的条件下振荡培养。接着，将100 µL培养物加入比色皿中，每种菌株对应加入900 µL的水。

随后，使用分光光度计测量光密度，并计算在最终体积为两毫升时达到光密度0.5所需的稀释倍数。然后，将每种菌株用10%甘油稀释至光密度0.5，并重新测量光密度，以确认细胞密度处于目标范围内。设置无菌工作区域后，点燃本生灯。

对于48针复制器，将每种稀释后的菌株各200微升加入96孔板的独立孔中，并在六乘八的孔阵空位中加入200微升10%甘油。然后将复制器浸入盛有95%乙醇的浅皿中，用火焰灭菌。火焰熄灭后，至少冷却两分钟，以避免对细胞造成热休克。

将四个平板放置在酒精灯附近并取下平板盖。将复制器浸入96孔板中，然后快速提起。接着轻轻将复制器放到平板上，并轻轻前后摇动，以促进良好的转移效果。

快速抬起并以完全相同的朝向放入96孔板中。一块板接种完毕后，平稳地移至一旁，但仍需保持在火焰的无菌范围之内。待平板完全干燥后再盖上盖子，通常需要三到五分钟。

然后，在 30 摄氏度下将平板培养三天。从培养箱中取出平板后，进行肉眼观察。生长实验表明，随着铜浓度的增加，剪接水平较低的菌株表现出汇合度下降，直至铜浓度达到致死水平。

酵母背景包含一个被破坏的 ADE2 基因，导致菌落呈现深浅不一的红色。成熟的菌落呈深红色。在涂布过程中，如果在左右移动时将复制器抬起、以一定角度移动，或在平板上方晃动，可能导致形成椭圆形菌落，或由少量细胞溶液液滴形成微小菌落。

携带A3c报告基因的酵母在0.15毫摩尔铜浓度下仍能存活，而野生型报告基因细胞在所测试的全部铜浓度范围内均保持活力。检测结果表明，U6 snRNA第57位的不同碱基与5'端或分支位点突变共同作用时，对剪接体具有独特的影响。其中U57c是一种累加性突变，与A3c及分支位点G报告基因联合作用时会降低铜耐受性。

相比之下，U57a 能够提高铜耐受性，因为它促进了向第二步的进程。在通过 ACT1-CUP1 鉴定出剪接扰动后，研究可进一步采用更定量的方法，例如引物延伸实验，以及通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）和酶促探针法鉴定受干扰的分子相互作用。ACT1-CUP1 作为一种基础性检测方法，推动了我们对酵母剪接体稳健性和选择性的理解。

并且不断拓展我们对剪接体功能的理解。