酵母作为研究人类P53功能检测方法开发的底盘系统

您好，我叫Bartolomeo Bosco，是意大利特伦托大学综合生物学中心转录网络实验室的一名博士生。众所周知，转录是一个极为复杂的过程，涉及转录因子和辅因子在空间和时间上的有序组织。其中大多数蛋白，包括人类P53，能够识别特定的顺式作用元件，称为反应元件，其与DNA序列的结合是调控靶基因转录所必需的。

在本研究中，我们希望向您展示利用酵母作为模式系统来研究P53序列特异性转激活功能的实验方案，该方案可通过颜色报告基因或荧光素酶检测，或通过细胞生长量化的手段，突出显示主要实验步骤及这些方法的多功能性。方案一：构建报告型酵母菌株，该菌株在腺嘌呤-2基因或萤火虫荧光素酶基因上游含有特定的P53反应元件。为构建报告菌株，首先按照步骤1.1至1.15，将靶向目标启动子区域的寡核苷酸转化至酵母细胞中。

转化基于标准的乙酸锂法。当转化子在5-FOA平板上出现后（通常在30°C培养三天后），将菌落复制到非选择性的YPDA平板以及含有G418的YPDA平板上，并对每个平板做好标记，以便后续比较。将平板在30°C下过夜培养。

第二天，在G418敏感但能在YPDA平板上生长的菌落中鉴定候选报告菌株。将鉴定出的菌落划线接种至新的YPDA平板，以获得单菌落分离株，并在30摄氏度下培养两天。通过PCR反应检测目标P53反应元件的正确整合，PCR反应条件见步骤1.20。

在Sanger测序前，将PCR产物的等分试样上样于琼脂糖凝胶，以检测扩增片段长度是否正确。方案二，我们提供一个示例，介绍如何利用基于颜色的定性腺嘌呤-2酵母检测法评估P53蛋白的转激活能力。采用第一节中所述的相同乙酸锂方法，将酵母细胞转化含P53表达载体的质粒。

在新的选择性平板上划线接种单个酵母转化子菌落，每板最多六株，于30度培养过夜。次日，使用无菌绒布将菌落影印至新的选择性平板上，以评估其颜色表型，即含有限量腺嘌呤的选择性平板。

在30摄氏度下孵育三天。相同的划线菌落可多次进行复制平板培养。方案三，我们现在展示一个使用基于定量发光的LUC1酵母检测法评估P53蛋白转录激活能力的示例。

首先，再次采用第二节中所述的基于乙酸锂的方法，将酵母细胞转化含有P53表达载体的质粒。将单个转化子接种于含有葡萄糖作为碳源的新鲜选择性培养板上，于30°C过夜培养。针对每种转化类型，制备5至7个不同的菌落斑块。

经过过夜培养后，使用无菌牙签或移液器吸头将少量细胞重悬于以棉子糖作为碳源的合成选择性培养基中。这些细胞悬液在600纳米处的光密度应约为0.4，随后可分装至多个96孔板中，用于在不同温度下培养、不同处理条件，或暴露于不同浓度的半乳糖以诱导P53表达。为检测萤光素酶报告基因活性，从透明的96孔板中转移10至20微升细胞悬液至白色384孔板中，加入等体积的裂解缓冲液与细胞混合，并在室温下于摇床上孵育10至15分钟。

加入 10、20 微升的萤火虫荧光素酶底物，并使用多功能酶标仪测量发光单位。同时测量 96 孔板中培养物的光密度。

方案四，我们现在展示一个利用P53诱导的酵母生长抑制效应的示例。使用P53表达载体转化酵母细胞，或共转化表达载体以共表达P53及其一种辅助因子（如MDM2），操作步骤同样遵循第一部分所述的乙酸锂法。将转化后的细胞在选择性培养基中培养至光密度约为1。

将它们稀释至0.05，并加入选定分子至适当浓度。在30°C条件下，于摇床中培养细胞42小时。然后，在最小选择性培养基平板中接种100 µL酵母细胞培养物。

在30摄氏度下孵育两天。通过菌落PCR可检测RE是否正确整合至ICORE盒的位置，方法是从候选酵母克隆中取少量细胞，并使用表三中描述的引物扩增靶向位点。PCR产物为一条约500个核苷酸的条带，可通过Sanger测序进行检测，以确认编辑后的基因组位点序列中存在正确的P53反应元件序列。

报告基因菌株已准备好用于功能检测。为评估P53蛋白的转录激活能力，需观察酵母菌落的颜色。例如，我们使用两种不同的报告基因P21-5-prime和PUMA，以及两种不同的温度（30摄氏度和37摄氏度），对野生型P53与突变体R175H和R282W进行了比较。

有趣的是，尽管 R175H 是一种功能丧失型 P53 等位基因，在所有条件下均形成红色菌落，而 R282W 则表现出温度敏感性：在 30 摄氏度时保留部分转录激活活性，形成白色菌落；在 37 摄氏度时活性丧失，导致菌落呈红色或粉红色。扩展数据集见图二 B。利用 10 种不同的 P53 反应元件报告菌株、三种温度条件以及组成型表达水平，检测了野生型 P53 及四种突变等位基因的转录激活能力。结果以颜色编码形式总结，该编码方式参考了酵母菌落颜色表型。

P53 K139E 突变等位基因保留了部分活性，并具有冷敏感性。例如，在 GADD45 报告基因菌株中，该突变在 24 和 30 摄氏度下形成的菌落呈红色，但在 37 摄氏度下则呈白色。在此，我们展示了利用该方法获得的结果示例，比较了人源和秀丽隐杆线虫（C.elegans）P53 在酵母中的转激活特异性。

柱状图中的结果表示为四次重复实验的平均相对发光单位及其标准误差。比较了五种不同的P53反应元件。通过改变培养基中半乳糖的浓度，检测了三种不同水平的P53蛋白表达。

这两个P53旁系同源物表现出显著不同的转录激活特异性。这一点可通过ced13和V1反应元件的结果加以说明：二者序列相同，仅存在或缺失一段28个核苷酸的间隔序列。人类P53在V1结合位点表现出更强的转录激活能力，而秀丽隐杆线虫（C.elegans）P53则呈现相反的模式。

结果与半乳糖诱导型启动子下P53表达水平无关。通过计数100微升培养液滴中获得的菌落数量来测量酵母生长情况。计算化合物对突变体P53的复活效应时，以表达野生型P53的酵母生长作为最大可能效应，设定为100%，而表达突变型P53的细胞生长则代表复活效应的零水平。

在此示例中，Nutlin-3a 解除了MDM2共表达对野生型P53的抑制作用，而PhiKan083则部分恢复了Y220C P53突变体的活性。在这两种情况下，均导致依赖P53的酵母生长抑制。酵母基础细胞模型已被证明可用于研究P53蛋白功能的某些特性与相关参数。

本研究中描述的方案在评估野生型或癌症相关突变型P53对靶位点不同变体的转激活潜能方面具有特别高的敏感性。此外，该方法还可用于鉴定影响P53功能的小分子，并用于研究P53与辅助因子的相互作用。通过使用显色报告基因、微型化的荧光素酶系统以及生长抑制试验，可建立成本低、可扩展的检测体系，适用于化合物文库的高通量筛选。

最后，本研究中描述的系统可轻松应用于其他序列特异性转录因子的研究。