利用Grafix技术检测瞬时相互作用蛋白 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 剪接体亚复合物

梯度固定法通过在交联剂存在下进行甘油梯度离心，有助于鉴定与多亚基复合物发生瞬时结合的蛋白质之间的相互作用。在甘油梯度中使用固定试剂可稳定松散因子的结合状态，且不会形成沉淀，从而能够鉴定特定蛋白质与剪接中间复合物之间的相互作用。本实验方案的最终流程演示可帮助初次使用者理解仅通过文字描述难以掌握的信息。

为制备酵母总提取物，将表达剪接因子与TAP标签融合蛋白的酵母细胞在1升Y和B葡萄糖培养基中培养，培养基中添加适当的氨基酸或核酸碱基。当培养物在600纳米处的光密度达到1时，将酵母细胞分三次用500毫升离心管离心收集，并每次用10毫升冰冷无菌水洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于相当于细胞体积十分之一的冰冷缓冲液A中，然后将50微升的酵母细胞悬液滴加至液氮中速冻。

冷冻后，将冷冻的细胞沉淀物置于球磨仪中，以20赫兹频率研磨六个循环，每个循环3分钟，每次循环结束后将装有冷冻细胞的容器浸入液氮中。最后一个循环结束后，将含有提取物的离心管放入室温水中，期间偶尔轻轻振荡。待完全融化后，离心以收集提取物。

采用 BCA 法测定澄清上清液中的蛋白质含量。然后将提取物分装后在液氮中快速冷冻，于 -80 摄氏度保存。制备甘油梯度时，向 30% 甘油和缓冲液 A 的混合液中加入终浓度为 0.1% 的交联剂戊二醛，并混匀至均一状态。

向一个12毫升离心管中加入6毫升冰冷的10%甘油缓冲液A溶液，使用配备长针头的梯度生成仪注射器，将30%甘油戊二醛溶液铺至管底。使用梯度生成仪，按照制造商的说明制备线性甘油梯度。在梯度顶部小心地加入200微升7%甘油缓冲液A垫层，然后在管顶部加入约2毫克的细胞提取物。

在生成甘油梯度后，将样品置于预冷的摆桶转子中，通过离心收集提取物。将每个12毫升样品管中的样品分装为24份，每份500微升，并使用蠕动泵将40%甘油溶液从10%至30%梯度的管中推入组分收集器。然后直接取每份50微升加样至点印迹（dot blot）的硝酸纤维素膜上，随后加入封闭缓冲液，使用针对CBP的一抗在免疫印迹上检测该蛋白，并根据需要使用适当的二抗。

在无交联剂的情况下，CWC 24 主要集中在第 5 至第 13 组分之间，对应于约 80 至 200 兆道尔顿的复合物。然而，在存在交联剂的情况下，CWC 24 在梯度中的位置向梯度底部移动，对应于更大的复合物。通过将 CWC 24 的沉降情况与 U5 snRNP 亚基 Prp8 和 NTC 亚基 Prp19 进行比较，发现 CWC 24 与它们集中在相同的组分中。

但是，由于它与剪接体瞬时结合，因此也存在于较轻的组分中。有趣的是，Prp8 和 19 开始富集的组分是 11 和 12，这表明 B Act 复合物从该区域开始沉降。对第 11 和 12 组分进行的 Western 印迹分析显示，Prp8 和 19 的信号呈弥散条带，几乎无法进入 8% 丙烯酰胺凝胶，表明它们确实是大型复合物的组成部分。

CWC 24 也存在于第 12 号组分中，但浓度要低得多，这与其短暂结合于 B Act 复合物的特性一致。综上所述，这些结果表明，戊二醛可作为交联剂，用于稳定瞬时因子与剪接亚复合物之间的结合。该方法可应用于研究任何动态的马达亚基复合物，这些复合物会短暂地与其部分组分发生关联，例如剪接体。