利用亲和层析法进行人基质金属蛋白酶-3的细菌表达与纯化

本详细方案描述了一种在大肠杆菌（E. coli）中高效且经济的细菌表达方法，用于表达重组MMP-3催化结构域，该方法也可应用于其他MMP治疗靶点。大肠杆菌缺乏复杂的蛋白质折叠和翻译后加工系统。本方法采用R2DP菌株以增强真核蛋白在大肠杆菌中的表达。

特定基质金属蛋白酶（MMP）的过度表达会导致多种疾病，如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。活性可溶性MMP对于开发MMP抑制类治疗药物至关重要。从LB氨苄青霉素-氯霉素抗性平板中挑取单个分离的pET His标签前体MMP-3催化域转化菌落，接种于5 mL LB氨苄青霉素-氯霉素抗性培养基中，在37°C条件下培养。

保存每种培养物的等份样品，并制备40%甘油菌种。用过夜培养物接种一个含有500毫升LB氨苄青霉素-氯霉素抗性培养基的1升锥形瓶，使600纳米处的光密度达到0.05至0.1。在多个时间点测定600纳米处的光密度，通常持续3至4小时，直至光密度值介于0.4至0.6之间。

用1摩尔的IPTG母液诱导培养物，使其终浓度达到1毫摩尔。在37摄氏度摇床中继续孵育3至4小时。在4摄氏度、13,000 G条件下，使用250毫升锥形瓶离心培养物10分钟，重复操作直至所有培养物完全沉淀。

每克菌体沉淀加入 3 毫升裂解缓冲液，通过涡旋或移液重悬沉淀。每升培养物加入 1.25 毫升 10%（质量/体积）的脱氧胆酸钠。每升培养物加入 10 微升 DNase I。

在室温下以150 RPM振荡30分钟。在13,000 G和4°C条件下离心10分钟。弃去上清液。

通过上下吹打，将沉淀重悬于100毫升/升的包涵体缓冲液中。超声处理期间将样品置于冰上，以防止过热。每个样品超声处理6个循环，每个循环15秒，输出功率为5，脉冲占空比为50%。

将样品在 13,000 G 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。检查沉淀。如果沉淀紧实，弃去上清液。

将每升培养物的沉淀重悬于5毫升溶解缓冲液中。冰上孵育至少30分钟，使蛋白质充分溶解。在4°C条件下，以13,000 × g离心10分钟。

若离心后形成沉淀，将上清液倒入另一个50毫升的锥形管中。用移液器反复吹打，每升培养物加入五毫升溶解缓冲液重悬沉淀。在4°C、13,000 ×g条件下离心10分钟。

接下来，收集上清液。弃去沉淀或将其在 -80 摄氏度保存，以备进一步超声处理。以 HT 洗涤缓冲液作为空白对照，测定第一次洗涤组分的 A280 值。

依次对其他组分重复此操作，直至 A280 接近基线。立即加入 5 毫升 HT 洗脱缓冲液，洗脱带 His 标签的蛋白质。以 0.5 至 1 毫升组分收集流出液，分装至预先标记为 HT 洗脱的微量离心管中。

测定洗脱组分的A280。如果A280大于0.3毫克/毫升，则用HT平衡缓冲液稀释该组分。将洗脱的MMP组分置于透析袋中，浸入1升透析缓冲液一中，并在4°C下用磁力搅拌器搅拌透析袋及其内容物至少8小时。

将透析管及其内容物转移至一升透析缓冲液二中，在4°C下使用磁力搅拌器搅拌至少八小时。接着，将透析管及其内容物转移至一升透析缓冲液三中，在4°C下使用磁力搅拌器搅拌不少于八小时。将样品转移至适当的容器中，并标记为透析后的MMP。

检查试管中是否有沉淀物。每1 mL浓度为1 mg/mL的MMP等分试样，加入50 µL的20 mM APMA，使APMA的终浓度达到1 mM。若出现沉淀物，则在4 °C条件下以最大转速离心10分钟。

将上清液储存于标记为“活化MMP”的1.5毫升微量离心管中。将沉淀物弃入标有APMA废弃物的容器中。通过SDS-PAGE分析，比较来自BL21 DE3细胞和R2DP细胞的His标签前体MMP-3催化结构域的His标签纯化洗脱组分。

带有 His 标签的 MMP 催化域在 BL21 DE3 细胞中的前八个洗脱组分所含蛋白量少于其在 R2DP 细胞中的相应组分。图中显示了 MMP3 CD 和 R2DP 细胞的诱导、复性、浓缩、活化及脱盐组分。活化后，活化的 MMP-3 CD 条带的分子量约为 20 千道尔顿，而带有 His 标签的酶原则保持在约 30 千道尔顿。

离心细胞裂解液时，沉淀物可能不够紧密。出现这种情况时，应增加超声处理时间并延长离心时间。在重新浓缩蛋白质时，可能会发生沉淀。

将其溶解于溶解缓冲液中，并重复该过程。本文所述方法提供了一种可溶性表达有活性的人源MMP的详细方案，最终可用于理解MMP酶活性的分子机制。也可采用其他蛋白质纯化方法（如FPLC）对MMP蛋白进行纯化。