蓝细菌中完整藻胆体的分离与表征

该方法是一种简单快速的实验方案，即使不熟悉蓝细菌的研究人员也能轻松完成藻胆体的分离。该技术的优势在于适用于小规模操作，且易于实施。这是一种简单、可靠且高效的分离模式与非模式蓝细菌完整藻胆体的方法。

首先将光密度（OD）为0.8（750纳米处）的细胞培养物转移至一个1升的烧瓶中，并用500毫升B-HEPES培养基稀释至750纳米处的OD值为0.2。在30°C条件下持续搅拌培养，直至OD值达到0.8至1.0，表明细胞进入后期指数生长期。在室温下以10,000 × g离心20分钟，弃去上清液。

用0.75摩尔磷酸钾缓冲液（pH 7）重悬细胞沉淀，并洗涤两次。在室温下，将细胞于50毫升离心管中离心沉淀。弃去上清液，并用0.75摩尔磷酸钾缓冲液重新悬浮细胞。

使用电子天平测量沉淀的湿重，并将一克湿重的沉淀重悬于五毫升缓冲液中。取一毫升细胞悬液，加入0.4至0.6克直径为0.1毫米的玻璃珠，放入一个两毫升带螺口盖的离心管中。使用珠磨破碎仪破碎细胞30秒。

将离心管置于室温水浴中冷却两分钟。裂解后，在室温下以500 × g的转速离心离心管10秒。用移液器将上清液收集至15毫升离心管中。

用0.5毫升0.75摩尔磷酸钾缓冲液洗涤磁珠一次，然后转移至同一离心管中。向裂解的细胞悬液中加入Triton X-100，在室温下以40转/分钟在摇床中孵育20分钟，或直至溶液变为均一。将离心管在17,210 ×g条件下离心20分钟，保留上清液（避免取上层Triton胶束层），于室温下保存最多一小时。

在 pH 7 的 0.75 摩尔磷酸钾缓冲液中配制四种浓度的蔗糖溶液。将 2.8 毫升 2 摩尔蔗糖缓冲液置于 40 毫升离心管底部，然后依次覆盖三层不同浓度的蔗糖溶液。最后，加入含有上清组分的 3 毫升 PBS，并对所得梯度进行离心。

经过超速离心后，浓缩位于各层之间以及集胞藻6803（Syn6803）和界面处的PBS组分及藻胆蛋白，并观察蓝色条带。使用0.75摩尔磷酸钾缓冲液反复浓缩和稀释各组分，并利用离心过滤装置去除蔗糖。为测定PBS荧光，将浓缩的PBS样品用0.75摩尔磷酸钾缓冲液稀释至终体积500微升。

将稀释的 PBS 样品加入透明玻璃管中，并在液氮中冷冻至完全凝固。将已冻结的玻璃管转移至预先装有液氮的透明杜瓦瓶中。细胞裂解完全的标志是在离心前可见上清液呈现深蓝绿色。

通过蔗糖密度梯度分离纯化的藻胆体（PBS）可得到多个解离的藻胆蛋白组分，其中最下方的组分代表完整的藻胆体（PBS）。JSC-1 和 Syn6803 的解离态与完整态藻胆体（PBS）的吸收光谱在 622 纳米处具有相同的吸收峰，对应于藻蓝蛋白（phycocyanin）。此外，JSC-1 解离态与完整态藻胆体（PBS）在 571 纳米处均可见藻红蛋白（phycoerythrin）的吸收峰。

解离后的PBS在Syn6803和JSC-1中均在约650纳米处呈现一个强发射峰，代表藻蓝蛋白的发射光谱。在651纳米和684纳米处的荧光发射最大峰表明，藻蓝蛋白捕获的能量被高效地传递至别藻蓝蛋白以及核心中的末端发射体ApcD和ApcE。该图显示了在紫外照射下经锌染色的SDS-PAGE，其中藻胆蛋白亚基具有强烈荧光，而ApcE荧光较弱，以箭头标示。

库马西蓝染色显示，上部组分含有其他非PBS水溶性蛋白，而完整的PBS和Syn6803显示出一条明显的ApcE条带（用箭头指示），该条带在解离的PBS组分中缺失。超速离心结果表明，按1:3比例制备的蔗糖梯度比按1:10比例制备的梯度具有更宽的条带。充分裂解细胞并完全溶解上清液对于获得更多的藻胆体至关重要。

其他方法，如冷冻电镜（cryo-EM）或质谱分析，可用于研究藻胆体的蛋白质结构或蛋白质组成。