丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存

本方案描述了如何通过自然转化对属于颤藻目（oscillatoriales）的丝状蓝细菌进行转化。同时展示了如何研究不同类型的运动方式。如果可行，自然转化是最简单的转化技术。

仅需DNA、细胞和培养基。迄今为止，其他颤藻目成员均未能通过自然转化进行转化。我们希望本研究能够激励其他研究团队尝试其他颤藻种类。

进行转化时，需制备生长良好且状态健康的菌液以及高质量的DNA。对于运动性研究，应始终使用经超声处理的菌液，且处理须为新鲜制备。

演示该实验步骤的是我实验室的技术员 Nora Weber。首先，从正在培养的 P. lacuna 菌丝中取 1 毫升，分别接种到两个装有 50 毫升液体 F2 培养基的 250 毫升锥形瓶中。在 25 摄氏度下，于白光条件下振荡培养约五天。

五天后，将 100 毫升 P. lacuna 细胞悬液在 10,000 转/分钟下均质化 3 分钟，并在 750 纳米处测定光密度。然后，在 6,000 × g 下离心细胞悬液 15 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 800 微升剩余液体及额外的 F2+ 培养基中。取八块含有 120 微克/毫升卡那霉素的 F2+ Bacto 琼脂平板，用移液器将 10 微克 DNA 加入每块琼脂平板中央。

立即将100微升细胞悬液加到DNA上方。将无盖的琼脂平板置于超净工作台上，使多余液体蒸发。盖上平板，在25°C白光条件下培养两天。

两天后，用接种环将每个琼脂平板上的丝状体分配到多个含 120 微克/毫升卡那霉素的新鲜 F2+Bacto 琼脂平板上。将平板置于 25 摄氏度的白光下培养，并定期在显微镜下检查培养物。14 至 28 天后，识别已死亡的棕褐色丝状体，并在显微镜下寻找转化后的丝状体。

转化后的丝状体呈现健康绿色，与大量未转化的丝状体不同。将每根单独的转化丝状体转移至含有10毫升添加250微克/毫升卡那霉素的F2+培养基的50毫升锥形瓶中。在25摄氏度、白光条件下于摇床培养，并观察长达四周的生长情况。

将丝状体转移回含有 250 微克/毫升卡那霉素的琼脂培养基中，等待丝状体生长。然后再次提高卡那霉素浓度以加速分离过程。对于 GFP 表达，使用荧光显微镜在 40X 或 63X 放大倍数下观察单根丝状体，并采集明场透射图像和荧光图像。

在白色光下，将 P.lacuna 接种于 F2 培养基中，以 50 RPM 的水平振荡培养约五天，直至在 750 纳米处的估计光密度达到 0.35。将样品储存在 4 摄氏度。以最大功率和 1 的占空比，用超声波处理丝状体一分钟，使其均质化。

在750纳米处测量光密度，并将含有P.lacuna的八毫升培养基转移至一个六厘米的培养皿中。等待数分钟，直至样品达到室温，然后用玻璃纸覆盖培养皿。将显微镜载玻片放置在配有相机的标准显微镜的X-Y载物台上。

打开显微镜光源，将4X或10X物镜移入光路中。然后，将培养皿放置在载玻片上方。通过载物台的X、Y和Z方向移动，调整单根丝状体或丝状体束的位置。

观察单根丝状体或丝状体束的运动，并使用标准显微镜相机记录其运动。确保物镜不接触液体。用移液器将0.5毫升含有P.lacuna的溶液滴加到六厘米培养皿的Bacto琼脂表面。

让液体进入表面。约20分钟后，盖上培养皿，使用4倍或10倍物镜观察表面丝状体的运动。使用目镜相机和微型计算机系统采集延时录像。

必须先通过肉眼对丝状体进行聚焦，然后通过目镜相机进行聚焦。确保后续图像之间的时间间隔为五秒至一分钟。对微型计算机的 Linux 脚本进行编程，以控制延时摄影的记录过程。

准备LED支架，将5毫米LED安装在支架上，以便从下方到上方照射20毫米见方的区域。测量并调节LED的光照强度。确保整个装置置于暗室或封闭的暗盒中。

将含有 P.lacuna 的八毫升培养基放入六厘米的培养皿中，盖上皿盖，并将其置于 LED 支架上，使 LED 位于培养皿的中心。通常两天后，使用智能手机摄像头直接对准光照处理位置拍摄培养皿的图像。使用支架并以白纸作为背景，以确保每次拍摄时距离和光照条件一致。

打开 ImageJ 软件，点击文件，打开，然后选择文件。接着，点击回车。选择直线按钮，按住鼠标左键，从培养皿的一端画线至另一端。

确保直线穿过丝状体圆圈的中心。点击“分析”和“测量”以查看培养皿的长度。然后，在 ImageJ 菜单中点击“分析”和“绘制轮廓”。

估算圆外像素强度的平均值，以及圆内像素强度的另一个平均值。将鼠标指针置于这两个值之间的 Y 位置，以估算圆两侧的 X 值。记录这两个数值并计算其差值。

然后选择直线工具，并在像素强度的半最大值处画一条线。最后，点击分析，然后点击测量，以获得内层细胞圆的长度。此处展示了P.lacuna与PAK1转化后插入片段的整合与分离。

转化后约一周使用外侧引物进行 PCR 检测，电泳凝胶上通常出现两条条带，一条为野生型大小的条带，另一条迁移较慢的条带表明抗性盒的插入。此处，泳道 1 至 4 分别代表转化后第 7 天、第 11 天、第 14 天和第 17 天丝状体的 PCR 产物，泳道 5 代表野生型的 PCR 产物。在第 7 天的样本中，插入片段仅存在于少量染色体中。

该比例持续增加至第17天，此时已无法观察到野生型条带，即分离已完全。此图像所示为在内源性藻蓝蛋白β启动子控制下表达sfGFP的pMH1载体。图中显示了P. lacuna的同源序列、pUC19载体骨架，以及包含sfGFP和卡那霉素抗性基因的插入片段。

在 pMH1 中，sfGFP 基因位于藻蓝蛋白 β 基因的 3' 端；因此，其表达由内源性 cpc beta 启动子驱动。此处展示了 P. lacuna 野生型菌丝以及经 PAK1、PAK2、PAK3 和 pMH1 转化后的荧光图像。sfGFP 的表达由 cpc560 启动子、a2813 启动子、psbA2S 启动子或内源性 cpc beta 启动子驱动。

此处展示的合并图像显示了席藻属拉昆亚种（Phormidium lacuna）的运动能力。图像展示了其在琼脂表面的移动情况，时间间隔为一分钟。

此处展示了在液体培养基中的运动情况。时间间隔为10秒。自然转化是一种简单的方法。

只需将质粒DNA与含有同源序列的抗性盒一起加入细胞中，然后让细胞在含抗生素的培养基上生长即可。基因可被失活，蛋白质可被过表达。这对于任何基础研究和生物技术研究都具有重要意义。

在已建立自然转化的单细胞蓝藻中，已开展了关于光合作用或光感受器等分子研究。