基于适配体亲和微珠的微流控声泳技术用于革兰氏阴性菌的流通式分离

本方案介绍了我们的微流控声泳技术，该技术可用于利用适配体修饰的微珠从培养基中快速、高效地分离革兰氏阴性菌。微流控声泳系统能够以合理的通量实现非接触式的细胞分离，从而分离革兰氏阴性菌。该技术可进一步优化，用于从医学和环境样本中分离细菌。

首先，设计一种微流控声泳芯片，当将聚苯乙烯（PS）样品混合物注入样品入口后，该芯片可将PS微球收集至目标出口，其余组分则被弃去。制备芯片时，将硅层上下两层与硼硅酸盐玻璃键合，并通过阳极键合工艺添加第三层硼硅酸盐玻璃层，施加1000伏电压和400摄氏度条件。

使用少于10微升的氰基丙烯酸酯粘合剂将PZT沿微流控通道固定在硼硅酸盐玻璃层上。将革兰氏阴性菌（GN）和革兰氏阳性菌（GP）接种于Luria-Bertani培养基中，在37°C、220转/分钟条件下培养16小时。将培养后的细菌在室温下以9,056 ×g离心1分钟。

然后用1× PBS缓冲液洗涤两次。通过将所选的革兰氏阴性（GN）和革兰氏阳性（GP）细菌重悬于结合缓冲液中，制备用于分析的细菌悬液。使用前将10微米的链霉亲和素包被磁珠混合物充分重悬。

将混合物涡旋振荡20秒。通过在95摄氏度下变性3分钟，然后在0摄氏度下复性2分钟，制备适配体。取250微升重悬的链霉亲和素包被的微珠混合液转移至1.5毫升离心管中，并向管中加入100微升生物素标记的DNA适配体。

将混合物在室温下孵育30分钟，同时以每分钟25转的速度旋转。在室温下以9,056 RCF离心反应混合物40秒。然后用200微升Tris-HCl缓冲液洗涤管壁两次。

向洗涤后的样品管中加入 10 微升浓度为 100 毫克/毫升的 BSA，于室温下旋转孵育 30 分钟，转速为每分钟 25 转。最后，用 Tris-HCl 缓冲液洗涤经适配体修饰的微珠两次，每次在室温下以 9,056 RCF 离心 40 秒。将 PEEK 管连接至两个用于注入样品和缓冲液的进样口，以及两个用于收集流出液和排放废液的出样口。

使用一个10毫升的注射器，将无气泡的去离子水注入微流控声泳通道中。准备一个具有两个或更多输出通道的精密压力控制器，以控制液体流动。设备准备就绪后，使用精密压力控制装置，在样品入口施加2千帕的压力，在缓冲液入口施加4千帕的压力，从而注入样品和缓冲液。

使用显微镜聚焦于微流控通道中的微珠，并利用压电陶瓷（PZT）将其移动至通道中心。通过单通道信号发生器产生 3.66 兆赫兹的共振频率，并使用功率放大器将典型信号放大 16 分贝。使用荧光显微镜和以每秒 1,200 帧运行的高速相机，观察声流控芯片上的分离与富集过程。

本研究中介绍的声泳芯片证实，随着PZT电压的增加，10微米大小微珠的中心浓度也随之增加。当PZT电压为5伏时，大部分10微米大小的微珠被富集在中心区域。出口处收集到的微珠数量与注入的10微米大小微珠总数之比称为回收率。

收集到的10微米大小微珠数量与收集到的微珠总数之比称为纯度。结果表明，该装置对尺寸为10微米的微珠具有较高的分离效率。使用配备高速相机的显微镜测量了每种经适配体修饰的微珠上结合的革兰氏阴性菌（GN）和革兰氏阳性菌（GP）的数量。

所有五种革兰氏阴性菌均与磁珠结合，而革兰氏阳性菌与所测试物质的结合量显著较少。革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌之间的信号强度存在显著差异。用于固定PZT的粘合剂应尽可能少使用，以确保波纹度的准确性，且PZT与微通道应保持平行。

该设备可用于在细菌感染性疾病的早期诊断阶段检测活菌或细菌来源的生物标志物。