一种用于在稳定浓度梯度下定量细菌趋化性的微流控装置

将大肠杆菌 RP 4 37 引入一种趋化性装置中，在该装置内它们会暴露于特定的空间浓度梯度。进入腔室的细胞会遇到浓度梯度的中点。根据信号被感知为引诱物或排斥物，细菌会迅速沿浓度梯度向上或向下移动。

您好，我是来自德克萨斯农工大学分子系统生物技术实验室和化学工程系的 Derek Engler。今天我们将向您展示一种利用微流控装置研究细菌趋化性的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于研究大肠杆菌 RP437 在硫酸镍浓度梯度中的迁移行为。

那么，让我们开始吧。流体层和控制层是通过将聚二甲基硅氧烷（PDMS）或聚甲基三甲氧基硅烷（Polymethyl SUBOXANE）在SU-8模具上进行复制模塑而制成的。开始此操作时，需将PDMS预聚物与交联剂按10:1的质量比混合。

将混合物置于干燥器中脱气一小时，直至去除气泡。当PDMS混合物准备就绪后，将SU-8模具放入培养皿中，并小心地将混合物倾倒于SU-8模具表面，达到所需厚度。将含有PDMS和SU-8模具的培养皿在80摄氏度下加热两小时，以固化PDMS。

两小时后，将固化并覆盖了PDMS的SU-8主模板从加热板上取下，并将PDMS模具从SU-8主模板上剥离。使用20号钝头针在PDMS模具上打四个孔，用于连接梯度发生器、细胞入口和细胞出口的管路。此时，我们已准备好组装PDMS装置，以实现PDMS装置的键合。

首先，用异丙醇清洁玻璃显微镜载玻片，并用气流吹干。接着，将PDMS模具和玻璃载玻片放入等离子体刻蚀仪中进行氧气等离子体处理，时间约为30秒。然后将PDMS模具与玻璃载玻片接触，将接触后的载玻片和PDMS模具置于加热板上，在65摄氏度下加热15分钟。

为了组装 PDMS 装置，使用剃刀刀片将管路以 45 度角切割至根据显微镜装置所需的确切长度。然后使用镊子将管路的一端插入装置上打出的四个孔中的任意一个。

将钝头的30号针头接头插入管路的另一端。对所有剩余孔重复进行管路和针头接头的插入操作。用一支3毫升注射器吸取1毫升趋化物质、缓冲液或CB。

注意从注射器中排出空气。使用移液器将CB加入出口针座，并轻敲针座以去除任何气泡。将少量CB从三毫升注射器的尖端推出，然后将注射器连接到针座，确保不混入空气。

推动CB通过装置，直至所有剩余的针座均充满CB，这将去除大部分气泡。接下来，用含有适当浓度待测趋化效应分子的CB填充两支500微升注射器。

通过推出注射器内少量液体以消除气泡形成，并接触针座中的液滴，然后连接注射器以制备高运动性细菌。进行趋化实验时，在32摄氏度下于胰蛋白胨肉汤（TB）中振荡培养大肠杆菌RP437（含GFP表达质粒）过夜培养物至次日。用该过夜培养物接种250毫升锥形瓶中的20毫升TB培养基，使600纳米处的光密度值约为0.05。

当细胞的 OD 600 达到约 0.35 至 0.45 时，在 32 摄氏度下振荡培养。通过低速离心收集细胞，并将细胞重悬于含有趋化效应分子的 CB 缓冲液中，使细胞的 OD 600 约为 0.35，趋化效应分子的浓度应与通道中部预期浓度一致。最后，将 RFP 标记的死细胞以 OD 600 约为 0.35 的浓度加入表达 GFP 的活细胞中。

这些死细胞将作为内部对照，以确保任何迁移现象并非由流动效应引起。此时细胞悬液已准备就绪，可加载至微流控装置中进行趋化实验。开始趋化实验时，从细胞进样针筒中取出部分 CB 缓冲液，并用细胞悬液重新填充。

缓慢地用重悬的细胞填充一支50微升的注射器。操作时应缓慢进行，因为鞭毛可能被剪切，从而降低细胞运动能力。将50微升注射器连接到进样针座上，如前所述，先推出注射器内少量液体形成液滴，然后将该液滴接触针座内的液体，再将注射器固定到位。随后将装置置于配备高速相机的荧光显微镜载物台上，用于图像采集。

将进样注射器放入注射泵中，启动流体流动，形成梯度，使细胞流经管路。当细胞进入趋化室后，等待约20分钟，使系统稳定。成像前，在趋化室长度方向上的不同位置采集活细胞绿色和死细胞红色荧光图像。

通常，我们在每个位置以三秒为间隔采集100张图像。所获取的荧光图像可使用任何市售的图像分析软件进行分析，例如Image J或Metamorph，也可使用Matlab编写的简单代码进行分析。在本示例中，我们将使用MATLAB代码。

首先通过设定的阈值像素强度去除图像中的背景像素，移除所有强度低于该阈值的像素，以最大限度减少噪声。在分析中，利用死亡细胞的位置来确定图像的中心。

这代表细胞进入趋化室的位置，也是在无迁移情况下检测细胞的位置。接下来，在图像中定位活细胞，将图像划分为多个通道，并确定每个通道内的活细胞数量。在我们之前的研究中，将宽为10至50微米的趋化室划分为64个通道，每个通道宽约16微米。

对所有图像重复上述步骤后，汇总各通道在所有图像中的总细胞数。由此可得到整个实验持续时间内各通道检测到的总细胞数。计算趋化性、分配系数（CPC），以表征细胞迁移方向。

通过执行以下步骤，分别为位于高浓度或右侧以及低浓度或左侧的死细胞区域中的每个细胞分配 +1 和 -1 的乘数。将所有乘积值相加，并除以检测到的细胞总数进行归一化。计算趋化性迁移系数（chemo taxes, migration coefficient）或 CMC，该系数根据细胞迁移的距离对细胞迁移进行加权。

移动到最高浓度位置通道64的细胞被赋予+1的权重因子，而移动到较高浓度一侧半程位置的细胞则被赋予+0.5的权重因子，移动到最低浓度位置的细胞权重为-1。将所有加权的细胞数量求和后，再除以细胞总数，以计算出CMC值。

该图显示了在微流控装置中使用异硫氰酸荧光素形成的线性浓度梯度或浓度分布。本图通过蓝色和黄色染料展示了浓度梯度的形成。细胞入口为CA，因此无流体通过，可以看出在蓝色与黄色之间形成了一系列过渡色。

以下是代表性趋化性实验的伪彩色图像，其中大肠杆菌RP 4 37暴露于装置中浓度从0到100微摩尔的L-天冬氨酸或从0到225微摩尔的硫酸镍的梯度环境中。每2.5秒对活的绿色细菌向L-天冬氨酸迁移或远离镍的运动过程成像一次，持续30分钟。呈红色的死细菌用作对照，以评估装置中流体流动的影响。

该图展示了在无浓度梯度条件下，微流控装置中RP 4 37的空间分布情况，并与天冬氨酸梯度和硫酸镍梯度下的响应进行了比较。我们刚刚向您演示了如何监测大肠杆菌RP 4 37在硫酸镍梯度中的趋化行为。进行此操作时，需注意尽量减少对细胞的涡旋处理，以便能够利用高运动能力的亚群细胞。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。