使用三维结构照明显微镜（3D-SIM）测量轴突起始段膜周期性骨架的特性

本方案可用于解析培养神经元轴突起始段中膜周期性骨架的结构。通过检测蛋白质的定位，可深入了解其在膜周期性骨架中的功能。该技术的主要优势在于其稳定性和操作简便性。

结构照明显微镜能够分辨膜周期性骨架，且样品制备简单直接。任何具有荧光显微镜使用经验的研究人员均可轻松实施该技术。本方案旨在样品制备和成像过程中最大限度地提高信噪比。

首先，在室温下使用 4% 多聚甲醛固定神经元 12 分钟。用含 0.2% BSA 的磷酸盐缓冲液洗涤盖玻片一次，并在室温下用含 1% Triton X 的 PBS 溶液孵育 10 分钟。用含 BSA 的磷酸盐缓冲液洗涤盖玻片，然后用含 BSA 的磷酸盐缓冲液按 1:200 的比例稀释抗锚蛋白 G 抗体。

加入抗体溶液至盖玻片，并在4°C下孵育过夜。用BSA磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次，再用含0.1% Triton X的磷酸盐缓冲液洗涤一次，最后用磷酸盐缓冲液洗涤一次。稀释Fluoro 4标记物，在BSA磷酸盐缓冲液中加入更多的二抗，然后加至盖玻片上。

用BSA磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次，再用含0.1%Triton X的磷酸盐缓冲液洗涤一次，最后用磷酸盐缓冲液洗涤一次。配制一微摩尔浓度的标记Ferodin磷酸盐缓冲液溶液，并加入细胞中。用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次，再用含0.1%Triton X的磷酸盐缓冲液洗涤一次，最后用磷酸盐缓冲液洗涤一次。

将盖玻片固定在载玻片上时，先在载玻片上滴加一滴封片剂，将盖玻片浸入去离子水中，再用柔软的纸巾轻轻拍打以去除多余水分。将盖玻片放置于载玻片上，室温孵育24小时。若条件允许，在成像前应咨询显微镜平台的技术人员，并使用浸油计算器选择适合样本的浸油。

样本准备好后，使用蘸有水或乙醇的棉签擦拭盖玻片，确保其干净且无任何残留物。将样本置于三维结构光照明显微镜（3D-SIM）中，找到细胞以采集图像。调节相应激光线的功率。

调整曝光时间以在不显著漂白样本的情况下最大化信噪比。设定样本在Z轴方向的上下限，然后进行图像堆栈采集。对图像堆栈运行重建算法，获得超分辨率重建结果。

检查重建结果中是否存在已知的伪影，如有必要，调整参数以校正这些问题。将SIM重建结果与宽场图像进行比较，以观察分辨率的提升。进行多色结构光照明显微成像时，当获得满意的重建结果后，使用对齐算法对不同通道进行正确对齐。

膜周期性骨架中的肌动蛋白环具有独特的周期性排列。在图像分析软件中，使用所有可见肌动蛋白环的焦平面生成最大强度投影图像。在最大强度投影图像上，穿过可见的相邻环绘制一条垂直线，并利用软件的线轮廓分析功能记录沿线的荧光强度。

为计算平均峰间距离，请记录线轮廓中的局部最大值，并测量相邻荧光强度峰值之间的距离。为评估不同蛋白质与膜周期性骨架中肌动蛋白环的共定位情况，需对肌动蛋白和候选蛋白的SIM重建图像运行共定位分析程序。在软件平台的共定位插件中，手动绘制选区以定义轴突起始段为感兴趣区域，然后运行分析以计算共定位的皮尔逊相关系数。

在SIM图像分析过程中，图像堆栈的重建结果显示肌动蛋白环具有明显的周期性。使用抗ankyrin G抗体对ankyrin G进行可视化。通过共定位分析程序计算Pearson相关系数，检测轴突起始段中ankyrin G与肌动蛋白环的共定位情况。ankyrin G与肌动蛋白环荧光信号共定位的Pearson相关系数为0.36 ± 0.03。

必须使用正确的浸油，并调整激光功率和曝光时间，以使网格线清晰可见。一旦确定某种蛋白质是膜周期性骨架的组成部分，便可进一步研究并明确其在维持膜周期性骨架结构中的功能。例如，可以分析敲低该蛋白质对肌动蛋白环的影响。

超分辨率显微技术的发展使我们了解到轴突起始段含有由肌动蛋白环、谱蛋白和锚蛋白组成的膜周期性骨架结构。SIM 技术使研究人员能够轻松地可视化膜周期性骨架组分，并在活细胞中观察肌动蛋白环。