骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

本方案可实现对脂滴的定量分析，并以肌纤维类型特异性的方式对其形态和亚细胞分布进行研究。该技术能够同时处理不同肌肉样本，节省时间，并避免单独处理时可能产生的假象。此外，该方法还允许对脂滴进行自动化定量。

在骨骼肌中评估了肌内脂肪变性，但该方案也可应用于不同状况下的人体组织，例如肥胖、衰老和癌症。在连续切片中识别相同的肌纤维可能较为困难，但一些显著的结构，如轴突扭曲或肌梭，可作为良好的解剖标志，帮助研究人员在两张切片上定位相同的肌纤维。首先，将肌肉样本的两张连续冷冻横切片分别置于两张预先标记的黏附载玻片上。

一张切片用于确定纤维类型，另一张用于定量脂质含量。进行肌肉纤维类型的免疫组织化学检测时，用疏水笔在切片周围画出轮廓。将其置于湿盒中，于室温下用冰冷的0.1摩尔PBS冲洗1分钟。

接着，移除 PBS，向切片中加入封闭液，在 37 摄氏度孵育 90 分钟。随后去除封闭液，加入含一抗的溶液，在 37 摄氏度孵育切片 90 分钟。在室温下用 PBS 洗涤切片三次，每次五分钟。

加入含二抗的溶液，在室温下避光孵育切片一小时，之后确保将切片远离光线，并用 PBS 洗涤三次，每次五分钟，然后用双蒸水冲洗切片，除去多余水分后，用抗荧光淬灭剂封片，并于 4°C 避光保存。使用 Bodipy 染色脂滴时，先用疏水笔在肌肉切片周围画出轮廓，再用冰浴的 0.1 摩尔 PBS 冲洗 10 分钟。两张切片必须同时进行染色。

用不含甲醇的4%冷多聚甲醛在室温下固定切片10分钟。初次快速漂洗后，用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。在湿盒中用含5%正常山羊血清的PBS封闭载玻片1小时。

随后将载玻片与含2%正常山羊血清和大鼠抗层粘连蛋白抗体的PBS溶液在室温下孵育90分钟。PBS洗涤载玻片三次后，加入含山羊抗大鼠Alexa Fluor 647抗体的PBS二抗溶液，室温避光孵育1小时。确保孵育过程中载玻片避光。

孵育后，用 PBS 洗涤载玻片三次。接着，将切片与 DAPI 和 BODIPY 溶液共同孵育 20 分钟。快速漂洗后，用 PBS 洗涤三次，再用双蒸水洗涤一次，然后除去多余水分，使用抗荧光淬灭试剂封片。

完成肌肉扫描后，将采集的数字图像上传至任意图像处理软件进行重建。根据肌纤维形态及肌肉切片的组织学特征，将图像以合适格式保存，并合并所有通道。对于Bodipy图像的观察与采集，按照文中所述，设置共聚焦显微镜参数，使用40倍油镜物镜，数值孔径为1.4。

为避免Bodipy与558、568以及层粘连蛋白Alexa Fluor 647之间的串色，请在共聚焦软件中使用顺序扫描模式。使用488纳米激光线或氩离子激光线激发Bodipy 493、503，使用561纳米二极管激光线激发Bodipy 555、568。最后，使用640纳米二极管激光线检测层粘连蛋白Alexa Fluor 647。根据所选染料，将Bodipy 493、503的发射波长范围设置为570至650纳米。

对于Bodipy，在565至620纳米范围内设置发射波长，对于558和568则设置为558、568。将层粘连蛋白（laminin）的发射范围设置为656至700纳米。接下来，适当调节增益和数字增益，以避免在范围指示器上检测到饱和像素。

通过调整偏移量来校正背景信号。为了在共聚焦显微镜下识别纤维类型，使用笔记本电脑查看先前重建的载玻片图像，该图像包含纤维类型的免疫检测结果。一旦正确识别出一组纤维，即用Bodipy和层粘连蛋白通道采集图像。

使用 Fiji 的 Bio-Formats 导入器打开每张图像。在视图堆栈中选择“超堆栈”选项，然后选择颜色模式为默认。确保已选中自动缩放窗口。

使用自由选择工具，根据层粘连蛋白通道手动选择纤维的肌膜。然后按键盘上的 T 键，在 ROI 窗口中记录感兴趣区域。转到 Fiji 主窗口，点击分析并设置测量参数。

然后在弹出窗口中选择区域，并针对突起直径保留其余复选框未选中状态，其他参数保持默认设置。在 ROI 窗口中点击“测量”，以获取所选纤维的面积和突起直径的最小值，并记录这些数值以供后续使用。计算突起直径最小值的六分之一，以界定纤维的中心部分。

单击 ROI 窗口，然后单击“添加”以复制第一个 ROI，并选择窗口中出现的第二个 ROI。在 Fiji 主窗口中，单击“编辑”，然后选择“选区”和“扩大”。输入先前计算的数值，数值前加上负号，然后单击“确定”。

在 ROI 窗口中，单击“添加”，此时将出现第三个 ROI，然后单击“删除”以移除第二个 ROI。在 ROI 窗口中选择前两个 ROI，然后单击“更多”，选择“ZOR”并单击“添加”，等待出现第三个 ROI，该 ROI 对应于纤维的周边区域。如果需要对相同的纤维重新分析，请单击“更多”后选择“保存”，以保存 ROI。

选择 bodipy 通道，通过点击 Fiji 主窗口中的图像、调整和阈值标签，打开阈值工具。在阈值弹出窗口中，将数值设置为 70 和 255。然后选择 YEN 和黑白方法。

在点击深色背景之前，最后点击应用标签。转到 Fiji 的主窗口，点击分析并设置测量选项。

在弹出窗口中，选择区域、区域分数并限制为阈值。其余选项和参数保持默认设置。转到 ROI 窗口并选择第一个 ROI。

在 Fiji 的主窗口中，点击“analyze”（分析），然后选择“analyze particles”（分析颗粒）工具。在“analyzed particles”（分析颗粒）窗口中，将数值范围设置为从 2 到无穷大，并勾选“pixels”（像素）复选框。保持默认的圆形度值，并在点击“okay”（确定）前选择“summarize”（汇总）。

为了获取纤维中心和边缘的数值，每次重复选择第二个和第三个 ROI。然后在汇总窗口中点击文件，再点击另存为以保存结果。在文件名中包含纤维的类型。

该免疫组织化学实验方案可用于识别小鼠骨骼肌中的慢收缩氧化型肌纤维（如Ⅰ型和ⅡA型）、快收缩糖酵解型肌纤维（如ⅡX型和ⅡB型），以及杂交型肌纤维的存在。通过测量肌纤维的横截面积和最小外径，采用基于尺寸的校正方法，以确定每根肌纤维的中心区域和周边区域。每块肌肉切片中的显著结构，例如轴突细支或肌梭，可作为良好的解剖标志，有助于在两侧切片上定位同一根肌纤维。

通过共聚焦显微镜获取 bodipy 标记层粘连蛋白染色的设置条件。允许同时对三至六条肌纤维中的脂滴大小、数量和分布进行可视化观察与分析。该方法还可用于量化三个重要参数，即脂滴所占肌纤维面积的百分比、脂滴密度以及脂滴的平均大小。

不正确的冷冻程序以及异戊烷温度未达到理想状态，会导致肌纤维内部形成冰晶。若切片未保持横断面方向，则无法在肌纤维、肌肉或动物之间进行脂滴定量与比较。第二张载玻片的处理必须与第一张同时进行。

冷冻切片后将载玻片空气干燥15分钟，可显著减少脂滴的大小和数量。Bodipy可用于研究脂滴与其他亚细胞器的相互作用，或与不同荧光光谱的蛋白共定位，或与基因修饰的GFP模型结合使用。肌内脂肪变性已被报道为多种疾病的不良预后因素。

因此，该技术可用于监测疾病的进展或评估治疗效果。