研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫

本实验的总体目标是检测秀丽隐杆线虫（C.elegans）在衰老过程中蛋白质不溶性的变化，并评估靶向基因敲降对这一衰老标志物的影响。该方法有助于回答衰老与蛋白质稳态领域中的一些关键问题，例如为何生物体随着年龄增长而无法维持健康的蛋白质组。该技术的主要优势在于能够在无疾病过程干扰的情况下，研究正常衰老过程中的蛋白质聚集现象。

尽管该方法可用于研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的蛋白质聚集，但也可适用于其他模式生物，例如用于研究小鼠中与年龄相关的蛋白质不溶性。开始处理时，向一个2,800毫升的Fernbach培养瓶中加入207.45毫升S Basal培养基，并根据随附的文字版实验方案添加其他试剂。加入终浓度为50微克/毫升的羧苄青霉素（Carbenicillin）和1毫摩尔的IPTG，然后用带膜的螺旋盖封闭培养瓶。

从25摄氏度培养箱中取出L1期幼虫，转移至15毫升离心管中。在1,900 ×g条件下离心3分钟。离心后，弃去上清液。

在显微镜下，计数每2微升中的L1幼虫数量，并对至少九滴样品的计数结果取平均值。随后，将50,000条线虫加入用于收集年轻线虫的四个 Fernbach 培养瓶中，将100,000条线虫加入用于收集老龄线虫的四个 Fernbach 培养瓶中（培养瓶已在前一步骤中准备好）。然后，根据线虫数量，按比例加入对照RNAi细菌和针对目标基因的RNAi细菌。

加入细菌后，用S Basal补足线虫培养物体积至300毫升。将线虫培养物置于25°C摇床培养箱中，以150 rpm振荡培养至收获阶段。在培养的第二天或第三天收集幼虫，以测定蛋白质溶解度的基础水平。

将蠕虫从一个烧瓶倒入分液漏斗中，在室温下静置沉降10分钟。待蠕虫沉降后，打开活塞，使蠕虫逐滴流入一个50毫升离心管中。接着，将蠕虫沉淀物分装至两个15毫升离心管中。

用 M9 培养基将离心管补至 15 毫升，离心收集线虫。洗涤线虫时，弃去上清液，再用 M9 培养基将离心管补至 15 毫升，重复离心操作。洗涤完成后，将线虫转移至两个 50 毫升离心管中，并用预冷的 M9 培养基将总体积补至 20 毫升。

为去除细菌和死亡的线虫，将两个20毫升的稀释线虫沉淀分别加入两个装有20毫升冰冻60%蔗糖溶液的50毫升离心管中。迅速离心处理。使用25毫升移液管，小心吸取最多15毫升的上层线虫层。

将上层线虫直接放入预冷的含有37毫升M9培养基和辛基酚聚醚-9（octoxynol-9）的冰上溶液中。然后在4°C条件下，以2,700 × g离心3分钟，加速度设为9，减速度设为7。弃去上清液后，将沉淀物转移至四个15毫升离心管中，用冰预冷的M9培养基加octoxynol-9洗涤两次。

然后，离心试管。弃去上清液，并用预冷的M9缓冲液加0.1%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（octoxynol-9）将试管补至15毫升刻度线。用预冷的M9缓冲液洗涤线虫，然后将四管样品合并为两管。

将试管加液至15毫升后离心。弃去上清液，向两支试管中加入室温M9培养基，定容至4毫升总体积，于25°C在旋转摇床上旋转混匀40分钟。旋转后，用冰预冷的含octoxynol-9的M9培养基洗涤线虫两次。

然后用M9缓冲液洗涤两次，并将线虫转移至一个离心管中。在收集前，用不含抑制剂的重装配缓冲液（RAB高盐提取缓冲液）洗涤线虫。去除上清液，直至虫体沉淀表面无液体残留。

然后，估测蠕虫沉淀的体积，并加入等体积含有抑制剂的RAB缓冲液。准备一个装有一半液氮的50毫升离心管，置于干冰上，用巴斯德移液管吸取蠕虫，缓慢滴入管中。待液氮完全挥发后，将冷冻的蠕虫于-80摄氏度保存，直至后续处理。

用液氮冷却研钵，并在干冰上进行动物组织破碎。将冷冻的蠕虫转移至预冷的研钵中，研磨2.5分钟。向粉末中加入100毫升液氮，再研磨2.5分钟。

使用显微镜检查，确保虫体已破碎成小片段。然后将粉末转移至2毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。在干冰上，每时间点每种RNAi细菌分别称取两份350毫克的研磨虫体，放入2毫升离心管中。

为了去除高盐可溶性蛋白，向每管中加入两倍于已准备好的含抑制剂RAB重量的溶液，以及终浓度为1毫摩尔的PMSF、200单位/毫升的DNase I和100微克/毫升的RNase A，并在冰上溶解粉末。将悬浮液用1毫升注射器抽吸15次，然后在冰上孵育10分钟。在4°C条件下，以18,400 × g离心20分钟。

穿过脂肪层，将含有高盐可溶性蛋白的上清液收集到每个条件对应的1个2毫升离心管中。去除脂肪并弃去。分装高盐可溶性蛋白样品，于-80摄氏度冷冻保存。

为去除脂质，用700微升含有蛋白酶抑制剂且含1摩尔蔗糖但不含DNase I和RNase A的RAB缓冲液重悬沉淀。将悬液用注射器抽吸10次，并在冰上孵育5分钟。务必彻底移除上清液及脂质并弃去。为去除SDS可溶性蛋白，用700微升RIPA缓冲液重悬沉淀。

将悬浮液用注射器反复抽吸10次，置于冰上孵育10分钟。在4°C条件下，以18,400 g离心20分钟。收集含有SDS可溶性蛋白的上清液，并分装后于-80°C冻存。

每种条件下，将两个样本分别用500 µL RIPA裂解缓冲液溶解后合并，将悬浮液用注射器抽吸10次。注意彻底移除上清液并弃去。用400 µL 70%甲酸溶解最终含有高度不溶性蛋白的沉淀，并将悬浮液用注射器抽吸20次。

将悬液在冰上孵育20分钟。将悬液转入超速离心管中离心，以去除线虫角质层碎片。收集含有高度不溶性蛋白质的上清液，并在-80摄氏度下冷冻保存。

对年轻和年老线虫中不溶性蛋白质组分的总蛋白染色显示，对照组动物中高度不溶性蛋白质水平随年龄显著增加，而长寿动物中则无此现象。对PAB-1（一种含有预测的朊病毒样结构域的RNA结合蛋白）的抗体染色结果证实了质谱分析数据，即长寿动物在衰老过程中仍能维持PAB-1的可溶性状态。对在咽部肌肉中表达tagRFP标记PAB-1的转基因动物进行了体内分析。

在幼龄动物中，tagRFP标记的PAB-1主要弥散分布于咽部。随着年龄增长，从后部咽球开始逐渐形成明亮的点状聚集。在衰老过程中，我们还观察到越来越多的动物在前部咽球出现聚集现象。

在野生型和daf-2突变体背景下，对不同年龄阶段tagRFP PAB-1聚集水平的定量分析显示，在长寿动物中，tagRFP PAB-1的聚集随年龄增长显著延迟。观看本视频后，您应能充分掌握如何收集大量线虫用于蛋白质提取，以及如何分离高度不溶性的大分子聚集体，以便进一步通过质谱或SDS-PAGE进行分析。