利用开源移液机器人实现高效的SARS-CoV-2定量逆转录PCR唾液诊断策略

我们开发了一种低成本、基于唾液的新冠病毒检测方法及配套工作流程，易于实施并可大规模推广，适用于广泛的社区筛查应用。本方法采用开源液体处理机器人、标准的热循环仪和软件，直接对唾液样本进行检测，无需核酸提取或稳定缓冲液，同时仍可提供准确的诊断结果。由于采用了简单且自动化的并行工作流程，该系统可扩展至每日完成数千次检测，且对设备、空间和人员的需求极低。

除了 Kylie King 外，我们的临床实验室主管 Rachel Ham 和教育协调员 Austin Smothers 也将协助演示该操作流程。首先用 70% 乙醇对唾液采集管外部进行去污染处理，并将其转移至实验室进行检测。通过将每个样本的条形码扫描到每日接收电子表格中，记录样本到达信息。将扫描后的样本在 95 °C 的烘箱中加热处理 30 分钟，然后使用耐热手套取出样本。

在样本分配工作站处打开每个样本加载机器人的每日样本加载电子表格。然后将188个样本分配至每块384孔板。使用板名称、日期和季度编号标记托盘。

按顺序将样本扫描至样本加样电子表格中。在样本加样工作站，排列两组完整的3D打印架，每组八个，对应机器人甲板上的放置位置。打开第一象限试管的盖子，并将其放入3D打印架中，从第一架的A1位置开始放置。

每个架子均从左至右、从上至下依次装载。在第二个架子上继续采用相同的装载模式，随后进行至第四和第五个架子。将装载好的第一象限样品架放置在第一、第二、第四、第五、第七、第八、第十、第十一个载台。

将P20吸头放置在第3和第9层甲板上。为简化设置流程，将材料从后向前装入机器人。主混合板在专用机器人上制备，并于4 °C保存。

一次使用一块板，标记板的名称，并用锋利的刀片在对照孔周围的封膜上划开一条切口。将主混合液板放置在第六层板位上，撕去封膜，仅保留覆盖对照孔的小块矩形封膜。打开移液头盒，关闭机器人。

通过机器人桌面应用程序点击“开始运行”，启动自定义的 Python 操作程序。每个象限加载到培养板上需要 24.5 分钟。请设置计时器以作提醒。

机器人运行期间，打开第二组3D打印样品架，将第二季度的样品管装入其中。当机器人暂停时，取下第一季度的样品架，替换为第二季度的样品架，然后在桌面应用程序中点击“继续运行”。将第一季度样品管重新盖上管盖，并存放在4°C冰箱中，等待结果。

对第三和第四象限重复此加样过程。将加样后的平板转移至生物安全柜中。为尽量减少污染，在转移过程中应保持平板盖好。

收集所有重复样本，并将其分配至第四象限的最后位置。对样本进行编号，扫描条形码，并将原始样本位置及结果录入样本加载电子表格中。将重复样本转移至生物安全柜。

请勿将重复样本管装入机器人加载架中。用移液器吸取2 µL每份重复样本加入指定的孔中。使用指定的移液器添加患者样本。

加样时，用铝箔覆盖对照孔，以尽量减少污染。使用镊子揭去对照孔上的铝箔盖。用移液器将2 µL经确认的阳性患者样本加入M23和M24孔中。

向 N23 至 N24 号孔中各加入 2 µL 无核酸酶水，向 O23 至 O24 号孔中各加入 2 µL 每微升 200 拷贝的混合阳性对照。P23 至 P24 号孔保持空置，用于监测主混合液批次质量。用光学透明封板膜覆盖板孔，并使用压膜滚轮将封板膜紧密贴合至所有孔位。

将酶标板在2,500 RPM下涡旋振荡30秒以充分混匀，然后在500 ×g下离心1分钟。在PCR仪软件中选择相应的程序协议，并保存该协议以供后续实验使用。将密封好的酶标板放入PCR仪中，运行程序。

导出CT值，并将数值复制到样本加样电子表格中。对于阳性对照，需确认至少一个阳性对照孔在P1和N1探针上的CT值介于22至28之间。或者，已知阳性样本孔在P1和N1探针上的P1和N1 CT值应小于33。

对于阴性对照，需确认两个阴性对照孔中均未出现 N1 或 P1 的 CT 值。在判定整块板无效之前，应先确认 CT 值具有有效的扩增曲线。如果 P1 的检测结果 CT 值小于 33，则视为该孔有效，并继续分析 N1 的结果；如果 P1 的 CT 值大于或等于 33 或无 CT 值，则视为该孔无效。

如果 N1 产生的 CT 值小于 33，则判定该孔为“是”；如果 N1 未产生 CT 值，则判定该孔为“否”；如果 N1 产生的 CT 值大于或等于 33，则判定该孔为“否*”。

确认所有 N1 的 CT 值均对应真实的扩增曲线。若 N1 的 CT 值无对应的扩增曲线，则该孔为无效孔。识别重复样本，用内部样本编号和样本类型进行标记，并将其返回至加样工作流程。

代表性图像显示了对N1或SARS-CoV-2合成RNA以及P1或HSRPP30合成DNA的RTq PCR检测结果。通过标准曲线并结合标准差，确定了该探针引物组合的准确检测范围。将各稀释度下获得的平均CT值对合成RNA和合成DNA的估计含量进行作图分析。

在这两种情况下，线性曲线在广泛的基因拷贝浓度范围内均显示出良好的相关系数。通过机器人和手动加样两种方式从独立样本中获得的N1 CT值被转录，以确定手动加样与机器人加样之间的方法间变异性。手动方法与自动化方法之间的线性关系产生了较高的相关系数，表明这两种方法在功能上是等效的。

通过机器人和手动加样获得的转录复制性 N1 CT 值，还确定了实验内变异度。本文展示了针对唾液黏度降低的热处理方法评估。SARS-CoV-2 阴性唾液来自单一供体，分装后分别在 95 摄氏度下进行 0 分钟、30 分钟或 60 分钟的热处理。

将每种条件的技术重复样本的P1 CT值进行绘图，以评估不同处理方法之间的变异性。30分钟和60分钟的热处理方法均显著降低了样本变异性，相较于未处理对照组。30分钟与60分钟处理之间无显著差异。

因此采用30分钟热处理方法以缩短处理时间。使用适当的无菌技术，以尽量减少检测平板的污染，特别是在加样手动样本和对照时。避免用手或袖子跨越平板上方。

临床结果产生后，样本可作为生物危害废物处理，或保存以用于进一步分析，例如全基因组测序以确定特定毒株。该技术可实现大范围的社区检测，使我们能够研究检测覆盖率以及新冠病毒无症状传播的影响。