通过逆转录-环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2病毒

我们的研究旨在将LAMP标准化为一种适用于现场或基层医疗环境的预诊断检测方法，其性能可与先进实验室设施中的检测相媲美。我们致力于推广使用本地可生产的缓冲液和替代性染料，以减少对进口商业试剂盒的依赖。目前，CRISPR-Cas是一种高效的系统，已被应用于开发快速、特异且灵敏的病原体诊断方法。

目前，该系统拥有一系列广泛的Cas酶及相关试剂，可用于检测不同样本中的RNA或DNA靶标。当前的实验挑战主要包括防止因扩增子污染和原始细胞扩增导致的非靶标扩增，尤其是使用容易形成二聚体的长引物时。此外，我们还致力于确定最佳反应条件，以实现染料颜色变化的常规可区分性。

一旦实现标准化并经过充分验证，该方法可在60分钟内以低成本、使用廉价设备在任何实验室或护理现场轻松实施和调整，用于检测几乎任何病原体。因此，该方法有望在基层医疗中心用于开展及时的流行病学监测。我们这个多学科团队致力于从哥伦比亚本土植物中发现分子，以探索其抑制登革病毒、寨卡病毒或SARS-CoV-2等病毒复制的潜力。

此外，我们正在开展研究，以开发针对这些病毒的分子诊断方法。首先，打开层流洁净台，使其稳定运行三分钟。使用以下消毒剂，以无菌操作方式清洁并消毒洁净台的内部表面。

将进入生物安全柜的任何物品消毒后，将纸巾和丁腈手套放入柜内。然后关闭安全柜，用紫外灯照射15分钟。照射结束后，重新启动安全柜。

将引物设计试剂放入装有冰块的保温箱中。用70%乙醇消毒后，将容器放入超净工作台内。在0.6毫升微量离心管中配制环介导等温扩增（LAMP）反应混合液。

用移液器吹打混合物以使其均匀。接着，将封闭的试管置于加热块中，在95摄氏度下孵育5分钟。然后将试管放入装有冰的聚苯乙烯冷却容器中冷却5分钟。

冷却后，将试管放入超净工作台中。为完成LAMP反应体系的配制，先加入4 µL DNA聚合酶，再加入1 µL逆转录酶。为进行比色检测，加入染料羟基萘酚蓝。

加入试剂后，用移液器吹打各溶液，以充分混匀LAMP试剂。接着，将22微升溶液分装至PCR管中，注意避免产生气泡。对于阴性对照，加入3微升0.1%焦碳酸二乙酯水。

将剩余的试管留出，用于添加遗传物质。接下来，从生物安全柜中取出所有物品。用70%乙醇对柜内表面进行消毒后，关闭生物安全柜。

在另一个区域，向每个 PCR 管中加入三微升样品，并使用 20 微升移液器充分吹打混匀。在启动比色反应之前，使用高质量相机拍摄 PCR 管的照片。现在，使用 PCR 仪和水浴锅进行反应。

对于热循环仪，将试管放入反应模块中，并在仪器上设置相应的温度程序。若使用水浴锅，请将试管稳妥地置于圆形容器内，然后将这些容器放入66.3°C的水浴中，反应60分钟。反应结束后取出试管，于4°C保存，待用。

如果进行了比色反应，应使用高质量相机拍摄PCR结果的图像。温度梯度实验表明，最佳熔解温度为66.3摄氏度。BST 3.0酶的浓度优化为每微升3.2国际单位。

为了确定比色策略，评估了酚红和中性红染料。然而，扩增后未观察到颜色变化。对不同浓度的羟基萘酚蓝进行了标准化，其中125微摩尔的羟基萘酚蓝产生了最佳的颜色变化。

扩增后的样品根据其浓度表现出颜色变化。通过电泳进一步确认了样品的扩增。