啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

我们开发了一种基于短暂眼内压升高的简单方法，可诱导出稳定且渐进性的青光眼退变。该方法为研究青光眼发病机制中的关键环节提供了独特的机会。该模型易于掌握、无创、成本低且具有高度可重复性，能够实现活体功能分析，并可在每项实验中使用较少数量的动物进行短期实验设计。

视网膜和视神经是中枢神经系统中可评估的部分，因此对这些结构进行渐进性损伤建模可为研究其他神经退行性疾病提供重要见解。为测量实验眼及对侧对照眼的基础眼内压（IOP），将麻醉后的大鼠仰卧置于实验台面上，使角膜表面易于接触眼压计的探针尖端。调整眼压计探针位置，使其垂直轻触中央角膜区域。

然后，按下测量按钮以获取测量数据。接着，将大鼠置于立体显微镜下，呈轻度侧卧位，并在40倍放大倍数下检查实验眼。在操作过程中，通过滴加一滴羧甲基纤维素钠或透明质酸钠，保持对侧对照眼的湿润。

接下来，使用弯头镊子轻轻将实验眼球向前推，以暴露围绕角膜缘360度的血管系统。然后，另一只手使用低温眼科烧灼器，轻柔地对角膜周围的所有血管进行烧灼。注意避免烧灼角膜周边部。

通过观察巩膜缘出现的小圆形烧灼痕迹、角膜缘血管闭塞以及手术眼瞳孔散大，确认手术成功。术后，按照之前所述方法检测双眼的即刻眼压。随后，向实验眼的前表面滴加一滴醋酸泼尼松龙眼药水。

40秒后，换用眼科抗生素软膏。每天使用由非甾体抗炎药和抗生素软膏组成的局部药物对实验眼进行临床随访。进行视动反应分析时，将大鼠置于由四台电脑显示器围成的四边形平台上的平台上进行适应性训练。

将红色十字准线光标保持在自由活动大鼠双眼之间的视频画面上，因为该位置指示虚拟圆柱体的中心。观察由旋转光栅刺激引发的大鼠头部和颈部的反射性追踪反应，即视动反应。最初使用低空间频率的刺激，然后逐步增加频率，直至不再观察到追踪运动为止。

记录图形视网膜电图时，先将大鼠麻醉，然后将记录电极小心插入角膜颞侧周边部。同时，将参考电极插入同侧眼外眦皮下组织，接地电极插入后肢之一。随后将大鼠置于距离刺激屏幕20厘米处，监测信号基线，按下采集系统上的分析按钮开始信号采集。

分离视网膜后，将其转移至含有1毫升PBS的24孔培养板中，保持内层视网膜朝上。用含0.5%非离子型表面活性剂的PBS溶液洗涤组织以进行通透处理。随后，在室温下轻轻振荡孵育组织与封闭液，持续一小时。

孵育期间，配制 Brn-3a 一抗溶液并置于 4 °C 保存。组织封闭后，将视网膜置于 200 µL 一抗溶液中，于 4 °C 轻柔振荡孵育 72 小时。随后，用 PBS 清洗组织。

将组织在200 µL的二抗溶液中室温孵育2小时，然后用细胞核复染溶液孵育10分钟以实现荧光核染色。经过三次PBS洗涤后，使用两把小刷子将视网膜转移至载玻片上，保持玻璃体面朝上。在载玻片上定位时，使视网膜的背侧象限朝上。

最后，在玻璃盖玻片上滴加 200 微升抗荧光淬灭封片介质，并将其覆盖在平铺的视网膜样本上，用于显微镜分析。使用共聚焦落射荧光显微镜，以 40 倍物镜观察平铺样本，以估算视网膜神经节细胞数量。眼球摘除后，切除视神经眶内段的近端部分，包括部分眼内段。

然后，立即将样品放入含有 200 至 300 微升冷固定液的小瓶或试管中。两小时后，用冷的 100 微摩尔/升二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织。接着，在 4 摄氏度下，于含 1% 四氧化锇和 5 纳摩尔/升氯化钙的溶液中轻轻振荡，对组织进行 1 小时的后固定。

用冰冷的二甲胂酸钠缓冲液清洗三次后，再用冰冷的蒸馏水洗涤视神经组织片段，随后在4°C条件下用1%醋酸铀溶液孵育过夜。次日，在用水洗涤三次后，用逐步递增浓度的丙酮溶液对组织进行脱水处理。然后，用环氧树脂-丙酮溶液进行三轮浸透处理，最后将组织置于纯环氧树脂中浸泡24小时以完成包埋。

第二天，将样本从样品载体中取出，并转移至包埋模具中，在60摄氏度下放置48小时。聚合完成后，使用超薄切片机切割视神经片段的横切半薄切片。然后，收集切片并将其转移至显微镜玻片上。

使用甲苯胺蓝对切片进行染色，并在光学显微镜下以100倍放大倍数观察并成像。对于超微结构分析，进行超薄横切切片，并将其收集于铜网上。然后，用醋酸铀和柠檬酸铅对切片染色，用于透射电子显微镜观察。

与对照眼相比，全环形烧灼术在术后立即引起眼内压升高。术后眼内压的峰值出现在第1天，随后逐渐下降，至第6天恢复至基线水平。此外，分别通过视动反射和图形视网膜电图从行为学和电生理学角度评估了视网膜功能。

术后，两个参数均显示出两个不同的损伤阶段：术后第3天出现的眼压升高急性期，以及术后第30天出现的继发性退变阶段。与对照组视神经相比，术后轴突数量及半薄横切面视神经切片均呈进行性减少。对照眼视神经的透射电子显微镜图像显示，髓鞘化纤维致密排列，由细薄的胶质细胞突起分隔，且可见明显的轴突微管和神经丝结构。

相比之下，在眼压升高三天后，观察到少量变性的纤维、胶质细胞突起中的胞质空泡化以及胶质细胞核内凝聚的染色质。七天后，变性轴突纤维和高渗性胶质细胞突起有所增加。而在14天后，视神经纤维的紊乱更加明显，并伴有胶质细胞突起侵入轴突之间。

此外，视网膜神经节细胞的密度随着时间的推移而降低，主要发生在视网膜的上方和颞侧象限。在进行该操作时，应尝试用烧灼头轻轻接触角巩膜缘血管，避免损伤睫状体周边部，并确保在巩膜缘周围均能观察到连续的烧灼痕迹。在完成该操作后，可应用多种方法进行后续分析，例如对眼部结构进行功能性生化和免疫组织化学评估，以及其他有助于阐明青光眼病理生理学机制的方法。