使用环形离子淌度质谱仪进行串联离子淌度实验
2022年1月20日
离子淌度质谱法（IMS）是质谱技术在生物分子表征方面的一种有益补充，尤其因为它对同分异构现象具有敏感性。本方案描述了一种串联离子淌度（IMS/IMS）实验，可实现对特定分子的选择性分离，并生成其碎片的淌度谱图。
本方案描述了如何记录分子在质谱仪中活化后所产生的碎片的离子淌度谱图，并用于区分异构体结构。该方案可将糖类根据其某些关键结构特征分为11类，从而提供其他方法难以获得的信息。该方法可用于构建分子网络，此类网络具有高度通用性，适用于多种分子家族，如在多个研究领域中具有重要意义的代谢物或药物。
该方法充分利用了离子淌度谱学中的一个新概念，在质谱法单独无法区分两种结构的情况下尤为有用。实验要求熟练掌握质谱技术和离子淌度技术。然而，只要严格遵循每一步操作，实验者应能成功实施该方法。
本实验操作将由我实验室的博士生 Simon Ollivier 进行演示。首先，在 Tune 页面中设置单次通过的 IMS 序列，将仪器置于 Mobility 模式，然后打开 Cyclic Sequence Control 窗口。在该新窗口的 Cyclic Functions 选项卡中选择 Advanced 模式，点击 Add Bundle，然后选择 Single/Multipass。
等待一系列迁移事件出现在同一窗口的“序列”选项卡中。调整该序列，使所有校准离子在环形离子迁移谱赛道上仅完成一次循环。请勿更改注入时间或射出与采集时间，但将分离时间降低至一毫秒。
如果校准混合物中的某些离子未落在显示的到达时间窗口内，可通过在ADC设置选项卡中增加每个时间通道的推扫次数，来调整离子迁移谱（IMS）与正交加速飞行时间（TOF）分析器推扫器之间的同步。在循环序列控制窗口中，若要记录两分钟的采集数据，请点击“采集”（Acquire）以打开采集设置弹窗，输入文件名、描述信息和采集时长（分钟），然后点击保存。从质谱调谐（MS Tune）页面将仪器切换至TOF模式，以检查信号的稳定性。
对样品进行一分钟的全扫描质谱采集，以用于检查同位素分布模式及潜在污染物的存在情况。在主调谐页面的四极杆/质谱轮廓选项卡中，将仪器设置为MS/MS模式。在MS/MS质量字段中选择目标铁离子的质量，以便在四极杆中进行离子隔离。
在处理数据时，记录一分钟的采集以检查前体离子的隔离情况。为了基于淌度选择目标异构体，请在循环序列控制窗口中将仪器切换至淌度模式，从循环功能选项卡中选择添加序列包，然后选择切片。等待一系列复杂的淌度事件出现在序列选项卡中。
将弹出和采集事件置于第一次分离事件之后，然后单击运行。实时观察初始分离的结果。通过在序列中调整该事件的时间值，延长第一次分离事件的持续时间，以实现多次分离，直至离子迁移谱峰的分辨率令人满意为止。
记录一分钟的采集数据作为参考。单击“暂停”，将“弹出并采集”事件置于“弹出”、“弹出至预存储”以及“保持并弹出”事件下方。调整各事件的持续时间，使目标峰位于“弹出至预存储”区域，而其他任何离子则处于“弹出”或“保持并弹出”区域。
将弹出和采集事件置于序列末端，位于从预存区重新注入和第二次分离事件的下方。单击运行以显示选定的细胞群，并检查分离效果的质量。
记录一分钟的采集数据作为参考。在“序列”选项卡中，查看用户自定义事件时间旁的一列，找到所有事件时间的累计总和。记录“从预存储重新进样”事件所在行的绝对时间（Time Abs），用于进行CCS校准。
将紧接“弹出并采集”之前的“分离”事件持续时间设置为一毫秒。在“从预存储重新注入”行中，勾选“启用激活”复选框，并使用内置控件优化碎裂效果。若使用内置控件无法获得满意的碎裂效果，则取消勾选“启用激活”复选框，转而手动优化重新注入电压，提高预阵列梯度，并降低阵列偏置电压，直至结果满意为止。
在“采集”弹出窗口中，为记录两分钟的采集数据，请勾选“保留漂移时间”选项，以生成仅包含到达时间、标记为 _dt.raw 的文件。对阿拉伯木聚糖五糖混合物进行质谱分析后，谱图显示同位素分布模式，在质荷比（M/Z）685.24 处出现单一峰，表明这两种化合物具有异构体性质。五糖的加合物通过环形离子迁移谱（IMS）池分离，得到三个具有不同到达时间的峰。
纯 XA3XX 在 83 毫秒和 90 毫秒处显示出峰，而 XA2XX 在 94 毫秒处出现峰。在第一级 IMS 分离后，属于 XA3XX 的离子被剔除，选择 94 毫秒处的峰进行 IMS-IMS 分析。在未活化的情况下将离子重新注入后，进行了三遍分离，在 199 毫秒处获得了 XA2XX 的峰。
利用到达时间与质荷比维度对生成的离子迁移谱-离子迁移谱-质谱（IMS-IMS MS）数据进行去卷积，得到离子迁移谱-离子迁移谱谱图。将相对强度高于0.2%的峰导出用于碰撞截面（CCS）校准，从而获得经质心化和CCS校准的离子迁移谱-离子迁移谱谱图。必须始终检查前体离子的分离情况，否则谱图可能来源于目标化合物与杂质的混合物。
我们此前曾利用IMS-IMS谱图构建网络并对化合物进行分类，但该技术也可用于与数据库比对以鉴定化合物。该方法非常新颖，但我们预计其在糖组学以及任何需要应对异构体分子的分析场景中都将极具应用价值。
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概述
本方案概述了一种用于表征生物分子的串联离子淌度谱法（IMS/IMS）实验，特别侧重于异构体的区分。该方法可将聚糖分类为不同的结构类别，从而促进分子网络的构建。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物分子表征
- 离子迁移谱
- 质谱分析
背景
- 离子淌度谱可作为质谱技术的补充。
- 该技术对异构现象具有敏感性，有助于结构分析。
- 该方法适用于多种分子家族。
- 糖类可根据关键结构特征进行分类。
研究目的
- 分离分子并分析其片段迁移特性。
- 有效区分异构体结构。
- 提供仅通过质谱难以获得的信息。
使用的方法
- 记录活化分子的离子淌度谱图。
- 基于淌度数据区分异构体结构。
- 将糖类分子分类为11个类别。
- 构建适用于多种研究应用的分子网络。
主要结果
- 该方案成功分离并分析了分子片段。
- 它能够有效对糖类进行分类。
- 该方法增强了区分相似结构的能力。
- 该方法可适用于多种分子家族，包括代谢物和药物。
结论
- 串联离子迁移谱/离子迁移谱（tandem IMS/IMS）方法是生物分子分析中的有力工具。
- 该方法能够提供传统质谱技术可能遗漏的信息。
- 只要严格遵循实验步骤，该方法具有良好的可操作性。
常见问题
行业重要性概要
环状离子淌度质谱（IMS/IMS）能够对异构生物分子进行高分辨的结构区分，弥补了糖组学和复杂代谢物分析中分析置信度的关键空白。该技术通过提供质谱单独无法解析的分子指纹信息，增强了早期发现与靶点验证的能力，支持基于风险评估的研发组合决策。该方法具有良好的重现性和结构特异性，对于面临异构体复杂性的生物制药研发管线而言，是一项重要的战略技术手段。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 实现对异构糖链和代谢物的精确结构分类，支持机制性风险排除。
- 提供分子指纹图谱，用于复杂生物样本中通路解析和靶点验证。
- 基于质谱单独分析无法获取的结构特征，实现对候选分子的可靠筛选。
筛选与检测方法开发
- 提供可重现且经 CCS 校准的谱图，用于检测标准化及后续筛选工作流程。
- 支持建立经过验证的参考数据集，用于高通量化合物评价。
- 通过实现对结构相似化合物的区分，提升筛选准备就绪度。
转化与临床前研究
- 在需要异构体分辨时，将分子分类与疾病相关生物标志物的发现相整合。
- 通过提供可靠的结构数据支持候选分子筛选，确保从发现到临床前验证的连贯性。
- 通过在复杂的生物基质中确认分子身份，降低转化研究风险。
流程与工作流整合
循环离子迁移谱/离子迁移谱（IMS/IMS）融入分析发现的连续过程，连接早期发现、先导化合物鉴定以及需要异构体区分的临床前工作流程。
- Discovery Biology：通过解析候选化合物库中的异构体结构，支持假设验证和生物学风险降低。
- Screening：提供定量、可重复的迁移率谱图和经碰撞截面（CCS）校准的输出结果，用于检测方法开发。
- Analytics：支持多维数据分析，包括分子网络分析和数据库搜索以实现结构注释。
- Translational Research：在转化研究中促进生物标志物比对和分子身份确认。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的分析平台，适用于多种分子家族，包括糖类、代谢物和药物。
运营与企业影响
- 科学价值：提高分子表征的预测置信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复的高分辨率结构分析工作流程。
- 战略价值：通过支持对结构复杂候选分子的决策，实现高效的资本投入和推进。
- 项目组合影响：通过为候选分子筛选提供可靠的结构证据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备质谱和离子淌度操作及数据分析方面的专业知识。
- 需要能够使用先进的循环离子淌度（IMS）仪器以及碰撞截面（CCS）校准标准品。
- 为实现可重复的数据采集与分析，必须在不同团队间进行严格的方法标准化。
- 在不同分子类别间应用时，可能需要针对特定样品类型优化实验方案。
- 分离质量和污染物控制对于可靠的结构指认至关重要。
