使用液相色谱-迁移谱-飞行时间质谱联用技术筛查芬太尼类似物

本研究的目标是开发一种方法，用于区分和表征异构体类似物。该研究旨在探讨是否能够建立一种方法，以可靠地鉴别大量化合物，特别是结构异构体。本方案整合了四种此前未被联用的表征模式。

采用四种正交鉴定方法来识别类似物，应能提高区分当前标准流程难以区分的异构体的能力。钛在阿片类药物泛滥中已成为重大的社会关切问题。每天都有新的类似物在激光实验室中被发现，若能建立一种可快速且可靠地确定样品中每种类似物变体的方法学，将有助于提升执法效率和毒品管控工作。

首先准备高效液相色谱（HPLC）所用的流动相。流动相A（MPA）为含0.05%甲酸的5毫摩尔每升甲酸铵水溶液；流动相B（MPB）为含0.05%甲酸的甲醇-乙腈（1:1）混合溶液。

开始进行高效液相色谱（HPLC）方法开发时，打开液相色谱（LC）软件并创建一个新的实验方案。然后点击编辑方法按钮以编辑二元梯度。在二元梯度选项卡下，设置MPA和MPB的时间戳和浓度。

将停止时间设置为18分钟，流速设置为0.400毫升每分钟，最低和最高压力限制分别设置为0和6,000 PSI。为初始化高效液相色谱仪，在HPLC色谱柱区域安装液相色谱柱及柱保护柱。请仔细观察色谱柱的最低和最高压力限制。

首先，开始进行 TIMS-TOF MS/MS 方法开发时，打开 TIMS 控制应用程序，在 MS 设置中将扫描起始值和终止值分别设为 50 质荷比和 1,800 质荷比。选择离子极性模式为正离子模式，扫描模式为并行累积串联碎裂（PASEF）。接下来，切换到源参数选项卡，将末端板偏移电压设为 500 伏特，毛细管电压设为 4,500 伏特，雾化器压力设为 3.0 巴，干燥气流量设为 10.0 升每分钟，干燥温度设为 200 摄氏度。在注射泵设置中，选择注射器为 Hamilton 1 毫升注射器。

启用 active 选项，并将流速设置为 80.0 微升每小时。在 MS/MS 选项卡的前体离子部分，将 PASEF 坡道数设置为 8，最低电荷数设置为 1，最高电荷数设置为 5。在调度设置中，启用前体重复，并在动态排除中勾选启用框，设置释放时间为 0.40 分钟后。

不要调整碰撞能量设置和隔离宽度设置。然后单击以启用 TIMS 步进框。为了对质荷比和迁移率两个区域进行校准，在质荷比校准设置下，从参考列表框中选择一个预加载的调谐混合物谱图。

进行校准，需将飞行时间质谱仪（TOF）的注射器中装入调谐混合溶液。在校准模式下，于窗口右侧选择线性、二次或增强型二次模式，以获得最佳评分。点击“校准”，使结果尽可能接近100%。

接下来，按照先前演示的质量-电荷比校准步骤，对迁移率进行校准。校准完成后，通过顶部工具栏中的方法选项卡保存质谱方法。在下拉菜单中，选择“另存为”以生成新的质谱方法文件。

在使用数据依赖性采集（DDA PASEF）模式收集 TIMS-TOF MS/MS 数据集后，需在离子淌度软件应用程序中运行数据非依赖性采集（DIA）。操作时，首先加载先前保存的 DDA 方法，然后将质谱模式更改为 DIA 被动碎裂模式。

保持所有其他设置不变。在 MS/MS 选项卡下，选择编辑窗口，然后使用 DIA 弹出窗口顶部的“打开分析”按钮，加载先前保存的 DDA 数据集。当左下角出现热图并显示一个沿对角线跨越图表的窗口多边形时，单击并拖动以调整多边形大小，使其与热图中的数据匹配。

设置每个质量宽度内的迁移率窗口数量及重叠度。点击弹出窗口右下角的“计算窗口”以查看应用新设置后的窗口分布。确认设置合适后，点击“应用”。

为处理芬太尼类似物筛查的高效液相色谱-离子淌度-飞行时间（HPLC-IM-TOF）数据，请首先在数据分析软件中检查校准情况。具体操作为：在分析框下的文件名上单击右键，选择“属性”。当弹出标有“filename_analysis 属性”的窗口时，选择“校准状态”。

从下拉框中选择质谱仪的仪器校准，并确认误差不超过 1 PPM。然后选择初始迁移率校准，并确认误差不超过 1%。在数据分析软件中准备色谱图时，右键单击文件名下的色谱图，然后选择编辑色谱图。在类型中，单击下拉框并选择提取离子色谱图。

在过滤器下，选择所有质谱（MS），扫描模式选择全部。若使用质荷比提取离子，请输入目标分子的理论质荷比。将极性设置为正离子模式，并将该离子添加到列表中。

若使用公式提取离子，请在色谱图中插入分子的公式以及目标离子形式。对于质谱图，确保已选中色谱图，然后在化合物峰一侧基线处单击右键，并拖动至峰的另一侧边缘。要生成迁移图，请在左侧标签页“mobiligram”上单击右键，然后选择“edit mobiligram”。

当标题为“编辑 mobiligram 色谱图”的窗口出现时，开始编辑色谱图。在保留时间输入框中，添加目标峰的保留时间范围。参数选择完成后，单击“添加”，然后单击右上角的“确定”。

为生成化合物谱图，在谱图视图窗口底部依次选择轮廓MS和碎片MS。在谱图视图中，右键单击并选择复制化合物谱图。为处理数据，单击“查找”，然后手动选择化合物、色谱图或迁移谱图。左键单击并拖动以高亮显示目标峰，从而获得有关目标分子的重要信息。

在特定芬太尼类似物筛查试剂盒中对四种异构体进行筛查发现，甲氧基乙酰芬太尼和芬太尼氨基甲酸酯在液相和迁移率维度上与对甲氧基乙酰芬太尼及B-羟基芬太尼实现了良好分离。然而，后两者的清晰分离可通过其碎片化图谱实现。另一试剂盒中对三种异构体的筛查显示，α-甲基硫代芬太尼与反式-3-甲基硫代芬太尼在液相维度上实现分离，但在迁移率维度上未能分离。

然而，反式-3-甲基硫代芬太尼与顺式-3-甲基硫代芬太尼在迁移率域中实现分离，而在液相色谱域中未实现分离。该数据表明，正交的液相色谱域与迁移率域在提升同分异构体物种鉴定能力方面具有互补性。